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Western Blot常见问题
来自 : 小蚂哥

1. 什么是westernblot?
答:WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。

2.westernblot 有什么优点?
答:灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便,特异性高。

3.westernblot 的具体步骤是什么?
答:一. 制样(以提动物组织总蛋白为例),
1)组织洗涤后加入3 倍体积PBS,0℃研磨。
2)加入5×STOPbuffer
3) 180W,6mins,0℃超声波破碎
4) 5000rpm,5mins 离心,取上清。
5)加入REB(9.5ml加入0.5ml),溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml)
6)煮沸,10min
7)分装,于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样。

二.电泳(SDS-PAGE)
建议欲检测抗原10-30kd, 用15%胶;30-100kd, 用10%胶;100-200kd,用7.5
%胶。
1)配胶(onepiece)A.分离胶。单位:ml。Total:8ml
7.5% 10% 15%
2×Sep.buffer444
30% Gel.sol2.02.74
ddH2O1.91.20
TEMED8ul8ul8ul
10%APS80ul80ul80ul
B. 浓缩胶。单位:ml。Total:3.5ml
3%
2×Stacking.buffer1.7
30% Gel.sol0.35
ddH2O1.4
TEMED5ul
10%APS50ul
2)点样。上样蛋白量不应超过30ug/mm2.(载荷面即:如果你的胶槽是5mm×1mm, 则
载荷面为:1mm×5mm=5mm2),
3)电泳。开始用80V电压,但是当溴酚蓝至分离胶时,用100-120V电压。
4)转移(一块胶)。
A.半干法。
a. 取六张滤纸(Bio-Rad,1mm),三张做上层滤纸,三张做下层。其中,
上层滤纸一定要比较干净,无污染。用前都用Transferbuffer 浸泡至少
五分钟。
b. 准备硝酸纤维素薄膜,用时先用甲醇浸泡1-3min.倒掉后,再用Transfer
buffer 浸泡。
c. 做三明治。阳极上铺三张下层滤纸,再浸泡过的膜,再铺胶,然后铺三
实验方法互助区——蛋白区
张上层滤纸,最后铺上三张上层滤纸,盖上阴极。注意每层之间不能有
气泡。膜上用铅笔画出胶的边缘。标上下。
d. 转移,0.8mA/cm2-3mA/cm2. 经验是:100kd-200kd,用2mA/cm2,2hrs;
30-100kd用1.0-2.0mA/cm2,40mins-1.5h;10kd-30kd%用0.5-0.8mA/cm2,
15mins-40mins.
B.湿法。
a. 取四张滤纸,两张做上层滤纸,两张做下层。其中,上层滤纸一定要比较
干净,无污染。
b. 准备硝酸纤维素薄膜,用时先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉后, 再用Transfer
buffer 浸泡。
c. 做三明治。
e. 转移。抗原≥100kd, 先28V转移1h, 然后84V转移14-16h,≤100kd,则
63V转移4-16h.

三封闭:5%牛奶4℃封闭过夜,或RT1hr.

四第一步反应:5%牛奶或2%BSA稀释抗体(称一抗),稀释比例按抗体说明,室温
孵育1hr,

五洗涤:TBST 洗5mins3-5 次。

六第二步反应:将膜跟5%牛奶或2%BSA稀释的2 抗一起孵育,室温1hr。

七洗涤:TBST 洗5mins3-5 次。
八显色:

4.westernblot 所需buffer 的配方是什么?
答:主要的buffer有:
1) 2×Separationbuffer(PH:8.8)
0.75MTRIS.HCl90.825g
0.2%SDS10ml20%SDS
Total:1000ml
2)30%gelSolution
0.8%kis-aciylamide0.8g
29.2%aciylamide29.2g
Total:100ml
3)10% APS:0.1g 溶于1.0mlddH2O.
4)2×Stackingbuffer(PH:6.8)
0.2MTris15.14g
0.2%SDS1gor5ml20%SDS
Total:500ml
5)10×Runningbuffer(PH:8.3)
250mMTris60.55g
1.9MGlycine285.27g
1%SDS20gor100ml20%SDS
Total:2liters
6)Semi-drytransferbuffer(PH:8.3):
48mMTris5.8g
39mMGlycine2.9g
0.037%SDS0.37g
实验方法互助区——蛋白区
20%MeOH200ml
Total:1000ml
7)Wettransferbuffer1(PH:8.3): (20-400kd)
50mMTris5.8g
380mMGlycine29g
0.1%SDS1.0g
20%MeOH200ml
Total:1000ml
8)Wettransferbuffer2(PH:8.3) <80kd
25mMTris5.8g
190mMGlycine29g
20%MeOH200ml
Total:1000ml
9)blockingbuffer:
5%milk5g
TBST100ml
※:奶粉为脱脂奶粉。
10)10×TBS(PH:7.6)
NaCl80g
Tris30g
Total:1000ml
11)TBST(PH:7.4)
NaCl25mM
Tris100Mm
Tween-200.2%
Total:1000ml
12)5×STOPbuffer(PH:6.7)
20%Glycerol100ml
10%SDS50g
250mMTris15.14g
用时取9.0ml,加入0.5mlβ-ME和0.5ml 溴酚蓝,可制成samplebuffer。

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