谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPx)说明书
谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)说明书
分光光度法50管/48样
注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与 ROS反应,生成氧化型谷胱甘肽 GSSG,从而保护生物膜免受 ROS的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。
测定原理:
GSH-Px催化 H2O2 氧化 GSH,产生 GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化 NADPH还原 GSSG,再生 GSH,同时 NADPH氧化生成 NADP+;NADPH在 340nm有特征吸收峰,而 NADP+ 没有;通过测定 340nm光吸收减少速率来计算 GSH-Px活性。
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1瓶,室温保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体×1支,-20℃保存。
混合试剂配制:临用前,在试剂二中加入试剂一 40mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三,
混匀。(注意:必须现配现用,当天使用完)
试剂四:液体×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
测定操作:
△A空白管=A空 1﹣A空 2。
△A测定管=A测 1﹣A测 2。
注意:空白管只需要测定一次。
计算公式:
(1). 按蛋白浓度计算
GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每 mg蛋白每分钟催化 1nmolNADPH氧化为 1个酶活单位。
GSH-Px(nmol/min/mgprot)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=536×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
分光光度法50管/48样
注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与 ROS反应,生成氧化型谷胱甘肽 GSSG,从而保护生物膜免受 ROS的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。
测定原理:
GSH-Px催化 H2O2 氧化 GSH,产生 GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化 NADPH还原 GSSG,再生 GSH,同时 NADPH氧化生成 NADP+;NADPH在 340nm有特征吸收峰,而 NADP+ 没有;通过测定 340nm光吸收减少速率来计算 GSH-Px活性。
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1瓶,室温保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体×1支,-20℃保存。
混合试剂配制:临用前,在试剂二中加入试剂一 40mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三,
混匀。(注意:必须现配现用,当天使用完)
试剂四:液体×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
- 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
- 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
- 血清等液体:直接测定。
测定操作:
- 分光光度计预热 30min,调节波长到 340nm,蒸馏水调零。
- 混合试剂在 25℃或者 37℃(哺乳动物)水浴中预热 30min。
- 空白管:依次在 1mL石英比色皿中加入 100μL 蒸馏水、800μL预热的混合试剂,100μL试剂四,迅速混匀后于 340nm处测定第 10s和第 190s的吸光值,分别记为 A空 1和 A空,
△A空白管=A空 1﹣A空 2。
- 测定管:依次在 1mL石英比色皿中加入 100μL 上清液、800μL预热的混合试剂,100μL试剂四,迅速混匀后于 340nm处测定第 10s和第 190s的吸光值,分别记为 A测 1和 A测 2,
△A测定管=A测 1﹣A测 2。
注意:空白管只需要测定一次。
计算公式:
(1). 按蛋白浓度计算
GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每 mg蛋白每分钟催化 1nmolNADPH氧化为 1个酶活单位。
GSH-Px(nmol/min/mgprot)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=536×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
(2). 按样本质量计算
GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每 g样本每分钟催化 1nmolNADPH氧化为 1个酶活单位。
GSH-Px(nmol/min/g)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=536×(△A测定管-△A空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:一定温度中,每 104 个细胞每分钟催化 1nmolNADPH氧化为 1个酶活单位。 GSH-Px(nmol/min/104 cell)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109]÷(细胞数量×V样÷V
样总)÷T
=536×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:一定温度中,每毫升液体每分钟催化 1nmolNADPH氧化为 1个酶活单位。
GSH-Px(nmol/min/mL)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109]÷V样÷T
=536×(△A测定管-△A空白管)
ε:NADPH摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm;V反总:反应体系总体积,1000μL=0.001L;
106:1mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);V样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3min。
注意事项:
(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;
(2)混合试剂和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使用完;
(3)测定过程操作须迅速;
(4)细胞中 GSH-Px活性测定时,细胞数目须在 300万-500万之间,细胞中 GSH-Px的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。
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发布于 : 2021-08-01
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