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2018-01-17流式细胞术的应用范围

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随着对FCM研究的日益深入,其价值已经从科学研究走入了临床应用 阶段,在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定,以及免疫学研究,并已开始用于细菌鉴定,病毒感染细胞的识别和艾滋病感染者T4、T8细胞的记数。
自70年代以来,随着流式细胞技术水平的不断提高,其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。
在肿瘤学中的应用
这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期,S期和G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。
(1)发现癌前病变,协助肿瘤早期诊断:人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程,而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时,在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变,FCM可精确定量DNA含量的改变,作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志,能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价,有助于癌变的早期诊断。有资料证实,癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系,增生程度越重,癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重,DNA非整倍体出现率增高,这是癌变的一个重要标志。
(2)在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用:FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可,DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据,FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大,敏感度高等优点,已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用,异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。
FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳的治疗方案,从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物,对瘤细胞达到最大的杀伤效果。
此外FCM近几年还被应用于细胞凋亡和多药耐药基因的研究中[3,4]。医学工作者开始研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因,FCM对多药耐药基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定,可为临床治疗效果分析提供有力依据。
在临床中的作用
FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析,进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。有大量文章介绍了淋巴细胞亚群等在各种疾病中的变化。正常人群淋巴细胞T4/T8比值大约为2∶1,但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应,如果T4/T8比例倒置,病人预后良好,较少发生肾排异现象;反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于艾滋病的诊断和治疗中。还有作者报告了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值,并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨[5]。
目前FCM用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种,可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。
在血液病诊断和治疗中的应用
FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析,对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。
(1)白血病的诊断和治疗:FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体,借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC,藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数,以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原,当形态学检查难以区别时,免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用[6]。例如干细胞表达CD34,髓系表达CD13、CD14,B细胞系表达CD10、CD19、CD20等,T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7,利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平,协助临床确诊。
同其它肿瘤的治疗一样,测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用,不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同,定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。
目前临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病[7]。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物,成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态,可以对预后做出早期的判断。
(2)其它种类血液病的诊断和治疗监测:阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病,细胞CD55、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。该抗原属于血细胞表面磷脂酰肌醇锚连蛋白家族,是重要的补体调节蛋白,它通过与补体C8、C9的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成,从而抑制细胞被补体激活溶解。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞CD59的表达做定量分析,可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度[8]。
(3)网织红细胞的测定及临床应用:网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标,FCM通过某些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)与红细胞中RNA结合,定量测定网织红细胞中RNA,得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高[9]。此外FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度,对红细胞增殖能力的判断很有意义[10]。为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。
在血栓与出血性疾病中的应用
(1)血小板功能的测定:正常情况下血小板以分散状态在血管内运行,但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断,FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况成为检查血小板功能的一种新手段[11]。该方法灵敏、特异性高。如果采用全血法测定,只需微量标本,适合于儿童及血小板减少性疾病的患者[12]。 血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变,FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62,CD63等)监测血小板功能及活化情况,有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。
此外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化,借助于钙离子敏感荧光探针的帮助,用FCM测定钙离子浓度,可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。(2)血小板相关抗体的测定:免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,其分子可以是IgG、IgA或IgM,用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体标记被测血小板,FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体,间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测,具有检测速度快、灵敏度高的优点。
质量控制
一、流式细胞仪的校准
流式细胞仪的校准包括流路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性。对仪器的校准主要是利用标准微球进行监测。聚苯乙烯可以被做成各种大小的微球,也可被荧光标记或者拥有定量免疫球蛋白的结合位点。这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球,已成为流式质控中的一个常用的标准品。
二、实验操作过程的质控
1、样本的质量控制
用于流式分析的样本种类很多,包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、组织活检物、浆膜腔积液、脑脊液、皮肤、黏膜(内窥镜活检物)、细针穿刺物等等。样本的条件控制可能是免疫表型分析质控最困难的环节之一。每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。首先,观测样本外观:有严重溶血、凝聚或坏死的样本应弃用。
第二,单细胞悬液的获取:外周血和骨髓穿刺液为天然单细胞悬液;活检组织常用机械分离和酶消化两种方法。不同的实验要求适用不同的方法。对于需要进行膜抗原标记的,不仅是要获得足够的单细胞悬液,还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性,机械法较适用。只需进行细胞周期或DNA倍体分析的,在机械法的基础上加酶消化(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)较适用。
第三,抗凝剂的选择:外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析,则应用EDTA抗凝;对于血小板分析的实验,一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题,通常不推荐用ACD作骨髓穿刺液的抗凝剂。
第四,样本的保存:理想状态下,样本应在采集后立刻进行处理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时/室温(16-25);EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小时/室温(16-25);ACD抗凝的外周血可保存至72小时/室温(16-25);对于只作胞内染色的样本,可固定细胞以长期保存。但此“固定-染色”的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式。
第五,去除红细胞的方法:红细胞裂解法,操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。最好在染色后溶血。若在染色前溶血,需确认:(1)抗原性不被溶血过程改变;(2)溶血剂被彻底洗去,细胞和抗体结合的动力反应未受影响;(3)所用溶血剂不含固定剂,否则会影响细胞活性及表面标记结果。密度梯度离心法,靶细胞回收较好并可能得到富集,同时去除红细胞、碎片等,但费时,某些重要细胞群体可能被选择性丢失。
第六,细胞与抗体的比例:厂家推荐的抗体用量通常是假定靶细胞数量在5X105 ~1x106范围内。有些标本没有足够的细胞,有些则由于细胞量大,正常浓度下的抗体相对过量或不足,导致假阳性或假阴性结果。因此,每个实验室应根据不同于厂家推荐的方法,调整细胞与抗体用量,得到最适的细胞/抗体比例。
第七,细胞活性的鉴定:死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色,这就使样本细胞活性检测变得非常重要,尤其是经过了长时间运输和储存的样本。检测的方法通常有两种:(1)实时的流式检测:利用荧光染料碘化吡啶(PI)、7氨基放线菌素D(7-AAD)或EMA(ethidium monoacide)进行死细胞染色,而活细胞拒染这些染料。此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。尤其适用于高度坏死的样本。7-AAD最常用,因为在488nm激发下,其最大发射光在670nm左右,适合与FITC 或PE进行多色标记。但随着时间延长,7AAD会在固定的细胞群体重新分配,死活细胞的区分变得困难。因此,对于染色并在固定后12小时以上分析的标本,最好用EMA。EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。(2)手工检测:使用Trypan blue 或其他细胞活性染料。(3)使用专门的仪器进行检测。如Vi-cell.
2、选择和确定单抗组合
流式分析最基本的试剂就是抗体。所选抗体的好坏直接影响结果。影响抗体特性的因素很多,如F/P比值、亚型、全长或片段、种宿来源、标记荧光种类等等。而且,有CD分类号的300多种单抗和大量没有CD分类号的单抗使抗体的选择更加困难。一般,选择抗体组合遵循以下基本原则:1)所选的抗体组合应足够宽,可以鉴别样本中的所有细胞亚群包括正常和异常群体。2)对表达少的抗原应尽可能选择荧光强度强的荧光素标记。3)了解不同抗体的细胞反应谱,以及染色模式。根据不同的实验目的选择抗体。因为相同CD编号的抗体可能识别不同的抗原决定簇。4)抗体的多种组合可能相互影响与抗原的结合(如通过空间构型的阻碍),所以对所用抗体组合,应先了解每个抗体在对照细胞上单色标记的表达情况。5)对于临床实验尽量选择体外诊断(IVD)试剂和分析特异性(ASR)试剂,而仅供研究用(RUO)试剂一般不能用于体外诊断实验。在我国,用于体外诊断的试剂还必须取得国内的SDA认证。这样,一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司,有不同的浓度、不同的亚型、不同F/P值,可能均需要自身的同型对照,而实际上,这是非常困难的。那么,尽量选择同一家公司的试剂可以减少上述的干扰。对于临床上常见的流式检测项目,所需的试剂组合基本都有参考或推荐的抗体组合。
如,T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3;阵发性血红蛋白尿(PNH)检测的CD55、CD59;血小板无力症(GT)检测的CD41、CD61等等。但对于白血病/淋巴瘤免疫分型,国际上迄今为止也没有统一的抗体组合。在2000年国际细胞分析学会(ISAC)大会上,临床血细胞计数协会组织了一次国际专家会议,以期对检测血液淋巴系统肿瘤所需最少、最有效的单抗数达成共识。75%与会者一致认为,对于慢性淋巴系统增殖性疾病(CLD)有9种单抗:CD5,CD19, κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45对初诊来说是最基本的。淋巴瘤和CLD相似,需要至少12-16种单抗。对于急性白血病(AL),75%的与会者认为大约13-15种单抗是最基本的:CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO,CD7,CD14,CD3,HLA-DR等,对初步鉴别白血病系列是必需的。其他一些(CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3)可能对某些病例有用。几乎所有的投票者都认为,要对急性白血病完善分类所需单抗的恰当数量平均为20-24种。但这些抗体之间组合也是一大难题,目前也无统一规定(如表二)。大会多数发言者(11/13)指出,对已确诊病人的监护和分期来说,仅需较少单抗。
抗体的质量控制是实验的关键环节。抗体的质量包括其特异性、灵敏度、精密度。对这一些,一些商业化的公司对常用单抗的检验均推出了一系列质控物。如BECKMAN COULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等(见表一)。
3、染色方法
细胞表面染色:大多数免疫表型分析均采用此方法。但由于许多抗原也同时存在细胞内,所以在细胞表面抗原检测时应特别注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性。表面标记又分溶血前标记和溶血后标记。若红细胞对标记有影响或血浆成分对标记有影响的,适合溶血后标记,但要注意溶血剂膜抗原的影响,所以,溶血剂一般不含固定剂。如免疫球蛋白轻链检测和阵发性血红蛋白尿的检测等。
细胞内染色:有些胞内抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要,如TdT, MPO, cCD3, cCD79a 。胞内染色的关键是使细胞膜通透,把抗体或核酸染料导入胞内而不影响细胞骨架的完整性。还要保证固定和透膜的步骤不影响有关抗原与相应抗体的结合力和核酸与染料的结合。某些适用于胞内染色的试剂可能不适于表面标记分析。通常胞内染色不能与细胞活性的检测同时进行,除非用EMA的方法。对于胞内染色,所用的荧光素应足够小到能穿透到胞膜内。对于某些核酸染料(如DAPI、TO、AO等)为活细胞染料,无需固定或透膜。
胞膜和胞内染色:通常,先胞膜染色,固定,膜通透和胞内染色,最后是DNA染色。
三、数据的获取和分析
流式细胞仪数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。由于流式细胞仪是基于对散射光信号和荧光信号进行分析的仪器,因此,仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定直接影响结果。同型对照的设定尤为重要。同型对照是指与单抗种宿来源相同、亚型相同、标记荧光素相同的未免疫动物的免疫球蛋白。同时考虑浓度、F/P值尽量相同,这样阳性阈值的界定才比较准确,特别是对于弱表达抗原阳性率的测定。而DNA倍体分析中参照物的设定非常重要,一般鸡红细胞作为内参照物。为了结果的可靠性,对获取的细胞量至少应在10000-20000个。但不同的实验目的对于获取的细胞量要求一般是不一样的,如DNA倍体分析,至少应获取10000个细胞;微小残留病灶(MRD)的检测,要求达到10-4数量级水平,则应至少分析100000个细胞干细胞移植中CD34的检测,应至少获取100个CD34阳性细胞或75000个有核细胞。
对于获取的数据,应保存在listmode文件中,便于分析。设门(gating)对于流式数据分析至关重要。设门实际就是确定分析区域。在DNA倍体分析中,设门实际就是圈定单个细胞,排除粘连细胞。对于细胞成分单一的标本(如培养细胞),设门比较简单。但对于成分复杂的标本(如骨髓)而言,准确的设门就不那么简单。前向散射光(FS)与侧向散射光(SS)设门干扰因素较多,目前,越来越多的被免疫标记物加散射光设门所取代。如,CD45/SS设门已成为白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34检测、MRD监测最佳的设门方法;CD19/SS设门对于成熟B淋系增生性疾病分析非常适用。
在数据分析中,百分率、荧光强度、DNA指数(DI)、多少个/ul是我们报告中常用的。百分率主要适用于检验指标集中在细胞有无的数量变化。如T细胞亚群检测、网织红细胞检测等;荧光强度主要适用于检验指标的变化集中在细胞上抗原量的多少。如血小板无力症(GT)的检测、慢性淋巴细胞白血病(CLL)CD20的变化等。DI用于DNA倍体分析。而艾滋病划分中外周血CD4的绝对定量、OKT3治疗监测中CD3的绝对定量、干细胞移植中的CD34的定量等等,最终都以多少个/ul的浓度形式表示出来。对于白血病/淋巴瘤免疫分型结果的分析,以前基本上都是以百分率的形式报告临床,但单纯的百分率结果并不能完整的反映肿瘤细胞的特性。因为20%人为认定的阳性判断标准忽略了低于20%的弱阳性结果,以及忽略了阳性结果之间荧光强弱的差别,而这一切对于白血病/淋巴瘤的诊断和分型却非常重要。目前,大多主张以文字描述抗原有无和强弱的报告方式,废弃百分率的报告形式。
四、临床检验的分析过程的质量评价
质量控制也必须重视检验方法学的选择和评价。任何一次实验都一定有误差,在一定意义上可以将误差分为实验方法学的系统误差及除此之外的随机误差。质量控制的方法和手段都只能减少或消除随机误差,但不影响系统误差。要使检验结果的误差控制在临床可接受的低水平或者允许的误差范围内,必须使用总误差水平符合临床要求的检验方法(包括仪器、试剂、具体操作方法等),才能保证检验结果在质量控制下符合临床要求。临床检验质量控制的目的,是监测实验过程中出现重要的误差时,用适当的方法警告分析人员。一般说来,检查实验结果质量的方法是测定质控物,最通用做法是将质控品和病人一起进行常规检验,了解检验质量则是将质控品测定的结果画在控制图上,观测控制结果是否超过控制限来决定失控与否。
在开始使用质控物的第一个月内,检验人员每天将质控物随机插入病人标本中进行检验项目的测定。月末对当月的测定结果(n≥20)做简单统计,求出均值x和标准差s。若检验结果的分布接近正态分布,结果的分布即可用均值和标准差来描述。这就意味着95.5%的结果在x+2s范围内,99.7%的结果在x+3s范围内。为便于观察质控结果,及时了解有何失效情况,常使用质控图。
按照正态分布规律:1)所有测定值应均匀分布于均值两侧,不应有明显不均之感;2)质控品测定值应有95.5%的可能性在x±2s范围之内; 3)不应有连续6次以上的结果落于平均值的一侧;4)不能有连续5次以上的结果有逐渐增高或降低的趋势性变化;5)不应有连续两次结果在x±2s范围之外; 6)没有一次结果在x±3s范围之外。
如果不符合上述规律,则说明结果失控。只有证实当天质控结果在控制之内,对当天的临床检验才能发出结果。一旦出现失控,则须查明原因,重新检验。对有1次检验结果超出均数2个标准差范围,提示警告。同批实验中2个质控品的结果之差值超过4s,也是失控规则之一,提示存在随机误差。连续4次质控结果同方向超出均数1个标准差范围,也是失控规则之一,提示存在系统误差。
五、室间质量评价
开展内部的质量控制使实验的受控项目达到一定的精密度。临床上往往只对实验结果是否可重复较敏感,若实验结果存在较稳定的系统误差,临床和实验室一般不易察觉,因此内部的质量控制还在于控制结果的不精密度。由专门机构定期向临床实验室分发质控品,要求各单位检测后返回测定结果,经过整理和统计,以数据和报告形式反映各实验室间及各分析方法间的差异,根据各单位测定结果与靶值的离散程度,计算出该实验室所的分数,及时反馈给参加者,便于改进工作。这就是室间质量评价的基本形式。室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确度,是对室内质量控制的补充。我国于2000年,由卫生部临床检验中心开始组织开展临床流式细胞术室间质评。现已开展了T细胞亚群检测和CD34绝对计数的室间质评。向左转|向右转

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