请教大家问题:我做的QPCR扩增同一个模板,结果熔融温度分别是74.45,74.17,75.71,75.09,75.21,73.93等,多数在74-75之间,73左右的就一个数值。原来做过用相同的模板扩增,熔融温度是》74《75之间的数值,熔融峰为单峰,且确定是目的基因,不是引物二聚体。并且,相同的标准品时隔一段时间(-80度保存),不同时间做PCR,结果CT值差别较大。有以下的疑问想和大家一起讨论:
1.熔融温度为75,74,73度的样品是否是同一个产物?熔融温度为56度的是不是没有扩增产物?
2.为什么相同的标准品不同反应CT值差别这么大?是不是荧光染料降解?我用的是试剂盒中的扩增酶,还没用几次。
3.扩增曲线的形态是否说明标准品已经有降解?
4.另外,我原来做CDNA梯度稀释做的挺好,可是这个直接是RNA为标准品,我用一步法进行QRT-PCR。标准品梯度稀释线性效果不稳定,有的时候好,有的时候不好。请假大家有没有好的建议?
附件中有扩增曲线和熔融曲线,请大家帮忙分析,谢过了!
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