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【求助】QPCR特异性问题
2021-08-12
问题描述:

请教大家问题:我做的QPCR扩增同一个模板,结果熔融温度分别是74.45,74.17,75.71,75.09,75.21,73.93等,多数在74-75之间,73左右的就一个数值。原来做过用相同的模板扩增,熔融温度是》74《75之间的数值,熔融峰为单峰,且确定是目的基因,不是引物二聚体。并且,相同的标准品时隔一段时间(-80度保存),不同时间做PCR,结果CT值差别较大。有以下的疑问想和大家一起讨论:
1.熔融温度为75,74,73度的样品是否是同一个产物?熔融温度为56度的是不是没有扩增产物?
2.为什么相同的标准品不同反应CT值差别这么大?是不是荧光染料降解?我用的是试剂盒中的扩增酶,还没用几次。
3.扩增曲线的形态是否说明标准品已经有降解?
4.另外,我原来做CDNA梯度稀释做的挺好,可是这个直接是RNA为标准品,我用一步法进行QRT-PCR。标准品梯度稀释线性效果不稳定,有的时候好,有的时候不好。请假大家有没有好的建议?
附件中有扩增曲线和熔融曲线,请大家帮忙分析,谢过了!

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蓝文轩
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个人认为:1、熔解温度为75、74、73的样品是同一产物;在图上没有看到熔解温度为56度的曲线,即使是在56°,应该不是扩增产物。2、从问题4可以看出,你以前用逆转录产物做实时荧光定量PCR,而最近是用RNA直接做,这中间就会出现由逆转录过程产生的误差。用RNA直接做的话,随着时间推移,降解越严重,而且,如果是直接稀释RNA的话,由于操作等原因,RNA降解更严重,准确度更差。用的次数不多的话,应该不是荧光染料降解的问题,只要保存(避光或低温吧)好就应该没事。3、很难从扩增曲线上看出标准品是否降解,如果要看的话,只能看CT值是否后移了。如果后移了,排除操作误差的话,应该是降解了。但是有时降解了,在扩增曲线上是看不出来的,因为如果你扩增的目的片段正好没有断裂或者扩增产物比较短时就会出现这种状况。4、RNA梯度稀释误差比较大,个人建议,逆转录为cDNA后再进行实时荧光定量PCR比较好,因为,cDNA较RNA来说比较稳定,易于长期保存,一年都没有问题,RNA降解很快的。以上仅是我自己的观点及经验,仅供参考,如有不对,请指出,谢谢!
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此时彼岸
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谢谢你的答复。我也赞成你的观点,我原来想过将RNA一次性逆转录为CDNA,然后每次操作就用CDNA作为标准品。但是由于RNA是试剂盒里的标准品,不知道逆转录成CDNA后,浓度怎么换算啊?我觉得不能直接从数值来换算吧。因为RNA是双链的,CDNA是单链的啊。还是直接测定OD值来换算?
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蓝文轩
  用户
我觉着你把RNA的量一致了就可以了,逆转录后取等体积的CDNA量进行。
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