周美玲
【摘要】：核酸作为重要的遗传信息生物分子,其检测被广泛的应用在食品安全、生物医学检测、环境检测等诸多领域。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是目前应用最广泛的核酸扩增检测方法之一,然而PCR技术需要专门的热循环仪,限制了其在疾病的即时诊断等领域的应用。因此,发展更灵敏、快速的核酸等温检测方法具有重要意义。本论文构建了几种简单、快速的核酸等温扩增检测新方法,分别对DNA和RNA进行了快速、灵敏和特异地检测。在第二章中,本论文建立了一种基于双切口分子信标的等温扩增检测DNA新方法的研究。用该方法对提取的大肠杆菌16S r DNA进行实时荧光检测,当检测靶标的量在100 fmol到10 amol之间时呈良好的线性,最低检测限为10 amol;通过在引物上设计突变碱基进行检测,验证了该方法具有较强的特异性;并用该方法在复杂体系中检测时呈现较强的抗干扰能力。此外,它是一锅式的等温链置换扩增方法,不需要额外的操作步骤,极大的简化了实验步骤,并降低了样品污染的可能性。它的这些优点使该方法在核酸的现场快速检测及即时检测(Point-of-care testing,POCT)中更具有实用性。目前的RNA检测方法中,大部分都需要利用反转录酶将RNA反转录为c DNA后再进行扩增检测。本论文第三章构建了三种无需加反转录酶可直接等温扩增RNA的实验方案,实现了对RNA的快速“一步法”检测。这几种方法都利用了本实验室发现的Bst DNA聚合酶既具有DNA聚合酶活性又具有内在的反转录酶活性的特点;此外,还充分的利用了DNA聚合酶的链置换活性及与切刻酶联用的扩增放大机理,最终实现了信号的多重放大。最优方法对大肠杆菌16S r DNA的检测可达1 amol,对大肠杆菌16S r RNA在一定的浓度下也可以进行有效的检测。这些方法均具有在等温、均相条件下可直接检测RNA。在RNA的检测中大大缩短反应时间,简化操作步骤,降低实验成本和操作难度。这些新的等温方法的建立为其他核酸检测提供了新方法与新思路,同时对即时检测也具有重要意义。
黄呈辉;欧阳玲;黄建国;黎淦平;陈汝光;;应用核酸扩增检测(NAT)技术对血液进行HBV、HCV和HIV-1筛查[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
