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DNA ladder法检测细胞凋亡 实验方法
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实验方法原理
发生细胞凋亡时,内源性核酸酶被激活,染色体DNA链在核小体之间被切割,形成180~200个碱基或其整数倍的DNA片段,将这些DNA片段抽提出来进行电泳,可得到DNA梯状条带(DNAladder)。
 
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、材料与试剂准备
 
1. 材料:凋亡细胞。
 
2. 蛋白酶K(500μg/ml),醋酸钾氯仿(8mol/L),无水乙醇,70%乙醇,2%琼脂糖凝胶。
 
3. 白细胞裂解液:pH8.0,10mmol/LTris-HCl,10mmol/LNaCl,10mmol/LEDTA,1%SDS。
 
二、操作步骤
 
1. 收集凋亡细胞:取1~2×106个细胞,离心后,立即用70%酒精(-20℃)固定2h。
 
2. 洗涤:取出酒精固定的细胞,1000r/min离心5min,去掉上清液,PBS洗二次。
 
3. 裂解细胞:加400μl细胞裂解液,充分混匀再加蛋白酶K100μl,置65℃水浴消化2小时或过夜。
 
4. 蛋白处理:加75μl8mol/L的醋酸钾,4℃15min,再加750μl氯仿,充分混匀后,10000r/min离心10 min后,将上清移至一新的Eppendorf管中。
 
5. 沉淀DNA:加入750μl无水乙醇,上下轻柔颠倒混合,即可见乳白色沉淀,若不明显时可置-20℃过夜,12000r/min离心10 min,去上清。
 
6. 洗涤DNA:加1ml70%乙醇,混匀,10000r/min离心5min,去上清。
 
7. 溶解DNA:根据DAN沉淀的大小,加一定量的蒸馏水或TE,37℃溶解。
 
8. 测定DNA浓度。
 
9. 2%琼脂糖凝胶电泳80V2小时。
 
三、结果判断
 
出现梯状电泳条带,最小的条带为180~200bp,其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带,无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大,迁移距离短,故停留在加样孔附近。
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