质粒的转化及转化子的鉴定实验一热激法
| 实验方法原理 | 热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 外源片段与载体的连接产物大肠杆菌感受态细胞 试剂、试剂盒 | X-galAmpLA培养基水抗生素 仪器、耗材 | 培养皿灭菌锅离心管摇床 实验步骤 | 1. lml X-gal (20mg/ml)，25 ml Amp（100mg/ml），250 ml制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250 mIPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中； 2. 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3. 每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； 4. 热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； 5. 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； 6. SOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；复苏：每管加400 μl 7. 布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板； 8. 培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时 即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子） |
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发布于 ： 2018-08-03
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