总RNA提取实验一试剂盒快速提取法
| 实验方法原理 | GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA，则根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 微生物动物细胞植物组织 试剂、试剂盒 | RNA提取试剂盒焦碳酸二乙酯乙醇 仪器、耗材 | 恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽 实验步骤 | 一、细胞或组织破碎 1. 微生物材料 （1）发酵3~4天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。 （2）用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次，并尽量除去残存的水。 （3）加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。 （4）研磨后的样品转移至12ml变性液的容器中匀浆。 2. 动植物细胞培养材料（适用的样品量为细胞：108） （1）细胞或组织培养：按常规方法进行。 （2）深层悬浮培养细胞的破碎。 ①细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3000g离心5分钟。 ③细胞破碎：在沉淀细胞中加入15ml预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。 3. 表面培养细胞的破碎 （1）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。 （2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8ml预冷变性液。 （3）转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。 （4）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推。 （5）直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。 （6）将上述12ml含细胞的变性液转移至一50ml无菌离心管中，匀浆破碎细胞。 4. 植物组织破碎（适用的样品量为0.05g组织） （1）将600ul变性液置于1.5ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。 （2）将0.05g新鲜组织用液氮冰冻。 （3）在液氮下，研磨组织块。 （4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。 5. 动物组织破碎（适用的样品量为1g组织） （1）将12 ml变性液置于50 ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。 （2）在上述管中加入1g新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。 二、RNA的抽提 1. 在经变性液匀浆的细胞或组织600ul+60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。 2. 600ul酚氯仿异戊醇（25241），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。 3. 冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟。 4. 上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。 5. 离心4℃，10000g，20分钟。 6. 沉淀RNA，冷冻干燥15分钟，RNA沉淀重新溶于300ul变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。 7. 60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。 8. 600ul酚氯仿异戊醇（25241），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。 9. 冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟。 10. 上层水相吸至无菌离心管中。 11. 等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30分钟），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥。 12. 复溶于去RNA酶的水中（对于准备长期保存的RNA可加入pH5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，-70℃保存。）。 注意事项 | 1. 研磨组织块用于RNA提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。 2. 变性液及相应的离心管需预冷。 其他 | 1. 变性液组成 25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mMpH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mMβ-巯基乙醇)，65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。 2. 酸性酚配制 55℃时，500g酚溶入500ml50mM，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500ml50mM，pH4.0乙酸钠，直到pH<4.1。 |
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发布于 ： 2021-07-25
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