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植物原生质体的制备一酶解法
来自 : 蚂蚁淘

植物原生质体的制备可以用于:(1)由于其具有再生细胞壁,进行连续的细胞分裂并再生成完整植株的能力;(2)具有摄取外源大分子、细胞器,以及细菌,病毒的能力,因此是进行遗传操作,基因转移的好材料;(3)通过同种和异种植物的原生质体融合,可产生异核体,实现体细胞杂交,培育出新品种。

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去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作,也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的首推Klercker(1892),直到1960 年英国科学家Cocking 才第一次用酶法大量制备原生质体。本实验以植物的叶肉组织为材料,利用纤维素酶和果胶酶来消化细胞壁,分离细胞。

1、取材 根据实验目的和条件选取不同的材料


2、分离原生质体


(1) 撕叶下表皮


(2)酶解 将撕去下表皮的叶片剪成小块,放在盛有5mL 酶液的小培养皿中,让去除下表皮的一面接触酶液,辅满一层,在25——28℃下酶解60——90 分钟


3、收集纯化


(1)用吸管将酶解液吸至5mL 离心管中,以600rpm 离心5 分钟以上,使原生质体沉降


(2)将上清(酶解液)回收,剩下原生质体及残渣于管底


(3)加氯化钙液约2mL,轻轻吹打均匀


(4)用注射器向离心管底部缓缓注入蔗糖约2—3mL,出现下部蔗糖液,上部原生质体悬浮液


(5)以600rpm 离心10 分钟,在两液相之间出现一条绿色带,便是纯净的原生质体


4、观察或培养


取少许原生质体于载片上,盖片观察其形态,或者将原生质体接种在培养基上进行培养,再生植株。


要培养悬浮细胞系需较长时间。因此,应着重改善培养条件,主要包括选用合适 的培养基 包括培养基 种类 、添加物 、激素种类及水平等 及培养方式 根 据培养物状态适时改换适宜培养基 选择合适的外植体及诱导时期 。
原生质体是裸露的、具有生命活性的细胞,体内包裹着细胞核、细胞器、细胞质等, 因此原生质体具有再生细胞壁、进行连续分裂并生成完整植株的能力 , 即具有细胞全能性。原生质 体能 摄 人 如 DNA、质粒 、病毒 、细菌 、细胞器等外源物质 , 是植物细胞工程进行遗传操作 、基因转移的良好材料 。

来源于《植物原生质体的制备与活力检测研究进展》生物技术通报。
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