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QA-Bio/2-AA Labeling Kit/LT-KAA-VP24
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QA-Bio/2-AA Labeling Kit/LT-KAA-VP24
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qabio
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LT-KAA-VP24
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The2-AAlabelingkitcontainstwosetsofthefollowingreagents(15samplesperkit)suppliedinglassampoulessealedunderpurenitrogen:  2-aminobenzoicacid(2-AAdye)  Dimethylsulfoxide(DMSO)  Aceticacid  Sodiumcyanoborohydrideor2-picolineborane

TrADItional2-ABand2-AAlabellingkitsusesodiumcyanoborohydrideasareducingagentduringglycanlabeling.Thisreagentistoxicsoafumecupboardshouldbeusedduringhandling.ToconformwithemerginghealthandsafetyregulationswearenowreplacingthesewithournewVPglycankitsthatusepicolineboranewhichisasignificantlysaferreductant.

NumberofSamplesOne2-AAlabelingkitcontainsreagentstolabelupto30separateanalyticalsamplesperkit.

Dyepurity>99%byHPLC

Molecularweight137

LamBDa-ex320nm

Lambda-em420nm

AmountofSampleFrom25pmolupto25nmolglycanspersample.

SuitableSamplesAnypurifiedglycanswithfreereducingterminicanbelabeled.

StructuralIntegrityNodetectable(<2molepercent)lossofsialicacid,fucose,sulfate,orphosphate.

LabelingEfficiencyTypically>85%(dependentonsample).

LabelingSelectivityEssentiallystoichiometriclabeling.

Protocol1. PurifytheglycansLudgerCleanEB10cartidges(LC-EB10-A6)havebeendesignedforpurificationofglycansfromproteins,salts,anddetergents.

2.TransfersampletoreactionvialTheamountofsampleshouldbeintherange100picomoles–50nanomolesforaglycanpoolobtainedfromatypicalglycoprotein.Withasinglepureglycanaslittleas5picomolescanbelabeledanddetectedinsubsequentHPLCanalysis.SuitablereactionvialsincludesmallpolypropylenemicrocentrifugetubesandtubesforPCRwork.

3. DrythesamplesIdeally,samplesshouldbedriedusingacentrifugalevaporator.IfthisisnotpossIBLethenfreezedrying(lyophilization)canbeusedwithcaution(inparticular,ensurethatthesampledriestoasmall,compactmassattheverybottomofthevial).Donotsubjectsamplestohightemperatures(>28°C)orextremesofpHastheseconditionswillresultinacidcatalysedlossofsialicacids(hightemperatures,lowpH)orepimerizationoftheglycanreducingterminus(athighpH).

4.PrepareaDMSO-aceticacidmixtureAdd150μLglacialaceticacidtothevialofDMSOandmixbyPipetteaction.

5.AddthedyeAdd100μLoftheDMSO-aceticacidmixturetoavialofthe2-AA(2-aminobenzoicacid)dyeandmixuntilthedyeisdissolved.

6.AddthereductantAddthedissolveddyetoavialofsodiumcyanoborohydrideorpicolineboraneandmixbypipetteactionuntilthereductantiscompletelydissolvedtomakethefinallabelingreagent.

7.Add2-AAlabelingreagenttosamplesAdd5μLoflabelingreagenttoeachdriedglycansample,capthemicrotube,mixthoroughly.

8.IncubatePlacethereactionvialsinaheatingblock,sandtray,ordryovensetat65°Candincubatefor3hours.Inmostcases,theincubationtimecanbeshortenedto2hoursorextendedupto4hourswithoutsignificantlychangingtheoutcomeofthelabelingreaction.

9.CentrifugeandcoolAftertheincubationperiodremovethesamples,centrifugethemicrotubesbriefly,thenallowthemtocoolcompletelytoroomtemperature.

10.SampleCleanupPost-labelingsamplecleanupisrecommendedtoremoveexcessdyeandotherlabelingreagents.CleanupcanbeachievedusingLudgerCleanT1cartridges(LC-T1-A6)orScartridges(LC-S-A6)

2-AALabelingReferences

Anumula,K.R.Quantitativedeterminationofmonosaccharidesinglycoproteinsbyhigh-performanceliquidchromatographywithhighlysensitivefluorescencedetection.AnalyticalBiochemistry220:275-283(1994)

Anumula,KR;Dhume,STHighresolutionandhighsensitivitymethodsforoligosaccharidemappingandcharacterizationbynormalphasehighperformanceliquidchromatographyfollowingderivatizationwithhighlyfluorescentanthranilicacid.GlycoBIOLOGy8:685-694(1998)

Anumula,KR;Du,PCharacterizationofcarbohydratesusinghighlyfluorescent2-aminobenzoicacidtagfollowinggelelectrophoresisofglycoproteins.AnalyticalBiochemistry275:236-242(1999)

Bigge,JC;Patel,TP;Bruce,JA;Goulding,PN;Charles,SM;Parekh,RBNonselectiveandefficientfluorescentlabelingofglycansusing2-aminobenzamideandanthranilicacid.AnalyticalBiochemistry230:229-238(1995)

Frears,ER;Merry,AH;Axford,JSScreeningneutralandacidicIgGN-glycansbyhighdensityelectrophoresis.GlycoconjugateJournal16:283-290(1999)

Huang,Z;Prickett,T;Potts,M;Helm,RFTheuseofthe2-aminobenzoicacidtagforoligosaccharidegelelectrophoresis.CarbohydrateResearch328:77-83(2000)

Sato,K;Sato,K;Okubo,A;Yamazaki,SDeterminationofmonosaccharidesderivatizedwith2-aminobenzoicacidbycapillaryelectrophoresis.strong>AnalyticalBiochemistry251:119-121(1997)

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我最近要做荧光定量PCR,不知道哪家公司设计引物,探针及PCR所用试剂比较好,谢谢各位提供帮助!
一个qpcr反应中是不是只需要一个探针引物就可以了
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引 物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中,有下面几点需要注意:

1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!

4. 所有成分加完后,离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔。
miRNA引物设计(茎环法+染料法检测)

设计方法:通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物,正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列,反向引物在茎环上。

反转录茎环通用序列:

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC

miRNA序列:

>mmu-miR-99b-5p
MIMAT0000132 Mus musculus miR-99b-5p

CACCCGUAGAACCGACCUUGCG

mmu-miR-99b-5p反转录颈环引物为:

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCAAG

定量PCR反向引物为:TGTCGTGGAGTCGGC

正向引物为:CACCCGTAGAACCGAC
PCR引物和探针 123
夏至chxdx2018-01-23
探针应用在Southern杂交反应中,引物应用在扩增反应中
在分子生物学中,探针是根据碱基互补的原理,用来与特定的DNA片段做杂交以对特定的DNA片段进行检测,如Southern杂交
引物是用来扩增DNA序列的,因为核苷酸必须要连接在3-OH上才能够合成延伸,引物就是用来提供3-OH的。
只要是符合要求的DNA片段都可以用来做探针和引物,引物是用来扩增DNA序列,探针用来与特定的DNA片段做分子杂交的
是RNA探针。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX。 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
如果你做的事荧光定量PCR,其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的,只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西,探针法还需要taqman探针,这个探针的设计是比较有讲究的,并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计,一般使用相关软件进行。
各位大侠,本人纯属门外汉,领导安排了任务要设计新的PCR引物或者探针的检验方法,由于本人专业不是很对口,所以希望各位可以给点意见或者具体的方法,感激不尽!!!

上面较高的是样本曲线,下面较低的是未加样本(茎环引物和引物、探针都加入)

本人做荧光定量PCR,参照基因选择的GAPDH,望好心人能告知GAPDH基因的引物和探针序列,谢谢
如果你做的事荧光定量PCR,其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的,只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西,探针法还需要taqman探针,这个探针的设计是比较有讲究的,并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计,一般使用相关软件进行。
可能这得看你的运气了~我每次反转录三四个都没有问题的~ 因为大部分的引物序列都是一样的~所以没事~不会错配~但是并不排除发生错配的可能~ 我们就有人反转录不出来~U6都出不来~那就分开弄~我没也就是普通的反转录的酶~m-MLV矮Ace矮都。
prR的引物一般是RNA(单链),而探针是已知碱基序列的dna或rna