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请教:elisa实验TMB底物孵育时间和温度的问题
2021-08-05
问题描述:

我用的试剂盒是avivasystem的,TMB底物加入之后感觉反应太过剧烈,加入之后高浓度的孔立即就开始变蓝,说明书是37度15-30分钟,孵育恰当的标准是:高浓度四孔变蓝色,低浓度(包含空白孔)无明显蓝色。我实际操作过程中,37度孵育15分钟已经全部孔变蓝,最终测下来od值过高,标曲八个点,空白0.2+,高浓度两空3以上,结果就是前六个点还是线性挺好的(r=0.9991),高浓度两个点完全不行。另一个问题是:我摸索了待测血清的稀释浓度,分别是不稀释、1/10、1/50、1/100,结果不稀释和1/10两个浓度测出来是负值(od小于空白对照),1/50和1/100测出来的值在标曲范围内(只取了线性好的前六个点),但是测值和稀释倍数也不成比例。请教各位:1.听人说TMB底物常温避光反应也可以,我能不能常温呢?这样我就好控制反应时间,还是继续37度孵育,把孵育时间缩短到10分钟甚至5分钟2.高浓度血清标本(不稀释、1/10稀释)测出负值应该怎么解释,厂家技术支持说可能浓度太大影响抗原抗体结合,这个能说得通吗?3.空白孔是不是应该不变色才对?空白孔显色是不是洗板时孔间污染导致的?要是这样的话,为什么前六点(含空白)标曲是好的?谢谢大家了

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dong3504269
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1.听人说TMB底物常温避光反应也可以,我能不能常温呢?这样我就好控制反应时间,还是继续37度孵育,把孵育时间缩短到10分钟甚至5分钟一般来讲标曲应当是厂家优化过后的,不应该存在这么大的问题,会不会是你在孵育完酶标抗体之后洗涤不充分,孔内残留的非特异性结合的酶标抗体太多,导致所有孔OD值偏高。常温避光也是可以的,37度只是因为这是酶的最适工作温度,换成室温的话,盒子的灵敏度肯定会下降2.高浓度血清标本(不稀释、1/10稀释)测出负值应该怎么解释,厂家技术支持说可能浓度太大影响抗原抗体结合,这个能说得通吗?这个是说的通的,术语叫做勾状效应(Hook effect),你百度一下就明白了,高浓度的抗原导致的假阴性,所以样本一定要稀释到合适的浓度。3.空白孔是不是应该不变色才对?空白孔显色是不是洗板时孔间污染导致的?要是这样的话,为什么前六点(含空白)标曲是好的?理论上是不显色的,但实际操作中,除了抗体与抗原间的结合外,难免有一些非特异性的吸附,这都会导致空白孔显色,空间污染一般会导致某一孔的OD值明显出现大的偏差,不会落在标曲上的
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jilin1117
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感谢楼上老师专业详尽的解答,我再试试看。小弟在此谢过
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pharmacology努力
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请问TMB微微有点蓝色还能用吗,我显不出来
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