Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒
试剂盒内含：AnnexinV，FITC结合物，PISolution，10×AnnexinVBindingBuffer
储存条件：0-5℃，避光(切勿冻存)
运输条件：室温
产品描述：细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、***脂酰丝氨酸的外翻等。
AnnexinV染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期，膜***脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性***脂结合蛋白，与***脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的***脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用绿色荧光FITC标记的AnnexinV通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。***化丙***(PropidiumIodide,PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此AnnexinV和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。
操作流程：
-悬浮细胞的操作流程
诱导凋亡的操作步骤
1.制备细胞(Jurkatcell)悬液(1×106 cells/ml)
2.加入终浓度为1g/ml的凋亡诱导剂(Staurosuporine)
3.在37℃下培养3.5h。
*Staurosuporine用于诱导Jurkatcell凋亡。最佳诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。
AnnexinV染色操作步骤
1.将细胞悬液转移到离心管中，1,000rpm离心3min， 去除上清液。
2.加入PBS，1,000rpm离心3min，去除上清液。再重复本步操作一遍。
3.用之前准备好的1×AnnexinVBindingSolution制备细胞终浓度为1×106cells/ml的细胞悬液
细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500l细胞悬液
4.取100l步骤3中制备的细胞悬液，加入到一个新的tube中。
5.向细胞悬液中加入5lAnnexinV,FITC结合物，再加入5lPISolution。
6.室温下避光培养15min。
7.加入400l1×AnnexinVBindingSolution，请在1h内检测。
-贴壁细胞的操作流程
诱导凋亡的操作步骤
1.制备细胞(Caco-2)悬液(1×106cells/ml)
将细胞悬液接种到培养皿或者培养板中。
2.在5%CO2培养箱中37℃预培养。
3.加入终浓度为25mol/ml的凋亡诱导剂(Cisplatin)。
4.37℃培养4days。
AnnexinV染色操作步骤
1.吸取培养皿或培养板中的上清液丢弃或转移至微型管中保存。
2.用PBS洗细胞2次，丢弃或收集清洗液保存。
3.用胰蛋白酶消化细胞。
4.用适量的培养基或PBS将细胞悬液转移至离心管中，如果第一步的上清液和第二步的清洗液没有丢弃，可以一并加入。
5.1,000rpm离心3min，弃上清。
*Cisplatin用于诱导Caco-2cell凋亡。最佳的诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整
6.加入PBS后1,000rpm离心3min，弃上清。重复本步操作一遍。
7.加入预先配好的1×AnnexinVBindingSolution，制成终浓度为1×106cells/ml的细胞悬液。
*细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500l细胞悬液。
8.取100l步骤7中的细胞悬液，加入到新的tube中。
9.向细胞悬液中加入5lAnnexinV,FITC结合物，再加入5l的PISolution。
10.室温下避光培养15min。
11.加入400l1×AnnexinVBindingSolution，请在1h内检测。
备注：1.上清液及清洗液中可能含有细胞或凋亡细胞，可以收集一起处理。
2.离心后如果无法判断tube中是否含有细胞？可以保留上清液，以防检测时没有细胞，进而得不到实验结果。
-设定对照
1.未染色细胞。
2.AnnexinV,FITC染色细胞(没有PI)。
3.PI染色细胞(没有AnnexinV-FITC)。
-流式细胞仪检测
1.加样到流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm；发射波长Em=530nm。
2.AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI的红色荧光通过PI通道(FL2或FL3)检测(建议使用FL3)。
注意事项：
1.PI有潜在的致癌性，操作时请特别注意并采取必要的防护措施。
2.AnnexinV,FITC和PI均对光敏感。所有染色过程和培养过程均需避光。
3.若细胞收集过程中使用胰酶，需设法去除残留的胰酶，这些胰酶会消化并降解AnnexinV,FITC，最终导致染色失败。
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发布于 ： 2018-07-01
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