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细菌过表达产物（无二硫键者）新纯化实验

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实验步骤	操作程序第1天今天的目的是试验T7RNA聚合酶表达的诱导条件，确定其在上清/沉淀中的分布情况，并为第二天的分离纯化步骤作出初步评估。 1)取一份50-ml经低密度培养过夜的大肠杆菌细胞培养物，开始工作。 2)于A600nm为0.3~0.7时，用0.8mmol/LIPTG诱导T7RNA聚合酶表达，将培养物分成两份。 3)30min后，对一份培养物加利福平至终浓度为150pg/ml。 4)诱导过程中，于各时间点取样作SDSPAGE分析：取1ml培养物离心后，按每单位A_600nm加100ul的2xSDS样品缓冲液溶解沉淀，踉踪诱导时间2~4h。 5)取完最后一个样品，合并培养物，用超声处理/DOC法（见P.146)破碎细胞，此时应能回答该蛋白是可溶的还是在沉淀中的这个问题。 6)若该蛋白存在于沉淀，可初步用SKL溶解法（见pp.148~149和p.173)筛査。若该蛋白存在于上清，则可试着筛选上清的PEI沉淀/洗脱条件（见PP.153~154和pp.l74~175)。完成这些实验后，把所有东西扔进废物箱，并为第2天制备更大量（1L)的培养物。第2天今天的目的是快速通过蛋白质纯化方案的前几步操作，筛选后面几步柱层析操作请用按第1天确定的最佳条件新鲜制备的1升培养物。 1)若蛋白质在可溶性组分中，可用PEI沉淀/洗脱法(PP.153~154)处理，然后筛选它与不同层析介质的结合条件。一般，建议先试离子交换剂（Q和/或S)和疏水作用介质（苯基-Sepharose)。先筛选结合条件，然后再筛选最佳结合条件下的洗脱条件。蛋白以分批方式（batchmode)吸附于层析介质后，再装柱、洗脱。 2)若蛋白在沉淀组分中，则可分成数份，以原先规定的SKL水平按几种蛋白浓度进行溶解。透析过夜。亦可试着用盐酸胍（GuHCl)或尿素对几份沉淀进行折叠实验。若沉淀不像所希望的那样纯，可试着用其他去垢剂（如TritonX-100,Tween-20,Brij-35)或低浓度的尿素、盐酸胍洗涤沉淀。待到明天，用凝胶过滤色谱法分析确定单体蛋白量与蛋白浓度及其他参数的函数关系。再制备1升以上的培养物。第3天今天的目的是通过蛋白质的主要纯化步骤，并进一步试验层析步骤。开始测活试验，并用双向凝胶电泳寻找电泳异形体（electrophoreticisoform)和/或共迁移的杂质。 1)若蛋白质是可溶的，则应有相当纯的物料，这时大概是稽奄可溶性聚集体和修饰蛋白（modifiedprotein)和试着进行活性测定的时候了。 2)若蛋白质在沉淀中，可能还必须用某种层析方法以除去残留的去污剂。展开

实验步骤

操作程序

第1天

今天的目的是试验T7RNA聚合酶表达的诱导条件，确定其在上清/沉淀中的分布情况，并为第二天的分离纯化步骤作出初步评估。

1)取一份50-ml经低密度培养过夜的大肠杆菌细胞培养物，开始工作。

2)于A600nm为0.3~0.7时，用0.8mmol/LIPTG诱导T7RNA聚合酶表达，将培养物分成两份。

3)30min后，对一份培养物加利福平至终浓度为150pg/ml。

4)诱导过程中，于各时间点取样作SDSPAGE分析：取1ml培养物离心后，按每单位A_600nm加100ul的2xSDS样品缓冲液溶解沉淀，踉踪诱导时间2~4h。

5)取完最后一个样品，合并培养物，用超声处理/DOC法（见P.146)破碎细胞，此时应能回答该蛋白是可溶的还是在沉淀中的这个问题。

6)若该蛋白存在于沉淀，可初步用SKL溶解法（见pp.148~149和p.173)筛査。若该蛋白存在于上清，则可试着筛选上清的PEI沉淀/洗脱条件（见PP.153~154和pp.l74~175)。完成这些实验后，把所有东西扔进废物箱，并为第2天

制备更大量（1L)的培养物。

第2天

今天的目的是快速通过蛋白质纯化方案的前几步操作，筛选后面几步柱层析操作请用按第1天确定的最佳条件新鲜制备的1升培养物。

1)若蛋白质在可溶性组分中，可用PEI沉淀/洗脱法(PP.153~154)处理，然后筛选它与不同层析介质的结合条件。一般，建议先试离子交换剂（Q和/或S)和疏水作用介质（苯基-Sepharose)。先筛选结合条件，然后再筛选最佳结合条件下的洗脱条件。蛋白以分批方式（batchmode)吸附于层析介质后，再装柱、洗脱。

2)若蛋白在沉淀组分中，则可分成数份，以原先规定的SKL水平按几种蛋白浓度进行溶解。透析过夜。亦可试着用盐酸胍（GuHCl)或尿素对几份沉淀进行折叠实验。若沉淀不像所希望的那样纯，可试着用其他去垢剂（如TritonX-100,Tween-20,Brij-35)或低浓度的尿素、盐酸胍洗涤沉淀。待到明天，用凝胶过滤色谱法分析确定单体蛋白量与蛋白浓度及其他参数的函数关系。再制备1升以上的培养物。

第3天

今天的目的是通过蛋白质的主要纯化步骤，并进一步试验层析步骤。开始测活试验，并用双向凝胶电泳寻找电泳异形体（electrophoreticisoform)和/或共迁移的杂质。

1)若蛋白质是可溶的，则应有相当纯的物料，这时大概是稽奄可溶性聚集体和修饰蛋白（modifiedprotein)和试着进行活性测定的时候了。

2)若蛋白质在沉淀中，可能还必须用某种层析方法以除去残留的去污剂。

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发布于： 2018-08-10 阅读（163）

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