| 实验步骤 |
三、方法将通过人类](POM)基因上间隔15kb的两个常见基因多态性POM-909g>c和Q192R来解释LE-PCR技术。POM-909g>c多态性和另一位于一108的影响转录程度的功能性启动子多态性呈现几乎完整的LD。Q192R影响底物特异性。在一项共有37877人参加的研究中，在两个位点都有混合的异源性基因型，从而形成混合单倍型。我们决定了这些个体的分子单倍型，并用两个底物测量酶活性（表型）。我们也对第三个多态性L55M,用尸〇] -909§><:和Q192R对在L55M和第二位点有混合异源性基因型的个体进行了分子单倍型分析。只需两次分子单倍型分析就可决定在所有三个位点都是异源型的个体单倍型。通过比较分子单倍型分析和推测单倍型对表型的预测效力，我们证明了LE-PCR人群研究中的应用（1)。本章只讲述针对POM-909g>c和Q192R的LE-PCR,不涉及表型的测量方法。整个LE-PCR的思路如图1所示。如模板下方所示，跨越多态性区域的两个扩增子在乳剂的水溶性液滴中产生。连接PCR将这些扩增子连接形成一个微染色体，并保留了这两个多态性的相关信息。 3.1引物设计 1.乳剂PCR中每个扩增子需两条引物，如图2A所示。扩增子应限制在200个核苷酸内。 2.外部引物是典型的PCR引物，大约25nt。根据我们的经验，引物GC含量为50%且以AA收尾为佳。 1.加帽寡核苷酸的使用如图4B所示。步骤3.5后有两个产物保留，包括微染色体以及从PCR清除过程中逃脱的单链副产物。加帽寡核苷酸3’端的磷酸化会阻碍它们作为引物。相反，它们作为模板来延伸副产物，以防这些产物做为引物参与PCR而产生新的微染色体。 2.我们的经验表明对副产物的加帽对于防止新微染色体的形成是不可缺少的。当 因多态性的各相信息。所以对每两个等位基因都有两对可能的微染色体。 2.计算时假定所有qASPCR引物在扩增PCR相应模板时的效率相等，正如我们的四个例子。如果不是，需进行合适的矫正。 3.计算第一对单倍型的平均C(值：这里为19277-909c+192C/-909g。 4.计算第二对单倍型的平均(^值：这里为192T/-909g+192C/-909c。 5.相减得ACz。 6.要求第一对可能的单倍型的两个G值应小于第二对可能的单倍型的两个Q;或者前者大于后者。因此四个qASPCR测量值中总有一对单倍型偏大。 7.ACi值必须大于1或者小于一1。这样qASPCR对某对单倍型测量的偏好程度远 8.如果条件6和7都满足，选用最低的（¾值。 9.如果条件6和7不满足，见注释3〜6。 四、注释1.管子必须与平台接触。 2.将管子悬挂在周边的装置配制乳剂的效果不好。 3.如观察到的ACt的值接近0,则LE-PCR失败， 4.在这项技术建立的早期，LE-PCR的失败率高达20%〜30%,但在改进乳剂形成后，失败率降到小于5%。 5.我们发现所有这些失败都发生在乳剂PCR步骤，并且不能通过纯化和分析步骤挽救。 6.如果有一个单倍型不能获得，重新再做全部LE-PCR实验 |
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