- ExpressgenesclonedintoanyT7vectorwiththeseBL21(DE3)derivatives
- Effectiveinexpressingtoxic&membraneproteins
- Citedinover350researcharticles
- InterestedinacompetentE.colistrainforroutineproteinexpression?Lookhere
E.coliBL21(DE3)strains,likeLucigen’sE.cloni®EXPRESSCompetentCellsprovidereliableexpressionofmanygenesclonedintoT7expressionvectors(e.g.,pETorLucigen’spSMART®-CDNAvectors).However,insomecasesexpressionisminimalornotdetectablebecausetherecombinantprotein,whenexpressed,isdeleteriousorlethaltothesestandardBL21strains.Examplesofsuchtoxicproteinsincludemanymembraneproteins,somecytoplasmicproteins,andnucleases.Unfortunately,successfulexpressionofoneormoretoxicproteinsisoftenimportanttotheexperimentalgoal.
Lucigen’sOverExpressElectrocompetentandChemicallyCompetentCellsareE.colistrainsthatareeffectiveinexpressingtoxicproteinsfromallclassesoforganisms,includingeubacteria,yeasts,plants,viruses,andmammals.Theeffectivenessofthesenewstrainsinexpressingtoxicproteinshasbeenvalidatedinmorethan350publications.
TheOverExpressstrainscontaingeneticmutationsphenotypicallyselectedforconferringtolerancetotoxicproteins.ThestrainC41(DE3)wasderivedfromBL21(DE3).Thisstrainhasatleastonemutation,whichpreventscelldeathassociatedwithexpressionofmanyrecombinanttoxicproteins.ThestrainC43(DE3)wasderivedfromC41(DE3)byselectingforresistancetoadifferenttoxicproteinandcanexpressadifferentsetoftoxicproteinstoC41(DE3).Figure1graphicallyillustratestheadvantagesoftheOverExpressCompetentCells,comparedtostandardBL21(DE3)cells,inexpressingtoxicproteins.
Figure1.GreenFluorescentProtein(top)orRedFluorescentProtein(bottom)expressedfromaT7promoterconstructthatwastransformedintoC41,BL21,orC43competentcellsspreadonIPTGplatestoinduceproteinexpression. |
Table1andFigure2summarizetransformationeffectiveness,toleranceofexpression-inducedtoxicity,andproteinexpressionforT7expressionplasmidscodingforavarietyofrecombinantproteins.TheseresultsdemonstratethattheOverExpressC41(DE3)andC43(DE3)strainsareclearlysuperiortotheparentalBL21(DE3)intransformationandexpressionoftoxicproteins.
Table1.ComparisonofOverExpressC41(DE3)andC43(DE3)cellswiththeparentalstrainBL21(DE3)intransformationandexpressionofheterologousproteins.**
Strain | Transformation SuccessRatea | Expression-inducedToxicityb | ExpressingPlasmidsc |
BL21(DE3) | 16/26(62%) | 25/26(96%) | 14/26(54%) |
C41(DE3) | 28/28(100%) | 14/28(50%) | 24/28(86%) |
C43(DE3) | 28/28(100%) | 1/28(4%) | 23/28(81%) |
Figure2.ComparisonofOverExpressC41(DE3)andC43(DE3)cellswiththeparentalstrainBL21(DE3)intransformationandexpressionofheterologousproteins.** |
aTransformationsuccesscorrespondstothepresenceofcoloniesonLB+ampicillinagarfollowingtransformationwithaplasmid.
bExpressiontoxicitycorrespondstotheabsenceofcoloniesonLB+ampicillin+IPTGagarfollowingtransformationwithaplasmid.
cExpressingplasmidscorrespondstoobservationofaheterologousproteininthetotalcellpelletonCoomassie-stainedSDS-PAGEfollowinggrowthofacolonyinLB+ampicillinmediumandinductionwithIPTG.
**L.Dumon-Seignovert,G.Cariot,andL.Vuillard(2004).ProteinExpressionandPurification37,203-206.Datausedwithpermission.
AsinstandardBL21(DE3)strains,OverExpressC41(DE3),C41(DE3)pLysS,C43(DE3),andC43(DE3)pLysSarelysogensof&lamBDa;DE3.ThesestrainscarryachromosomalcopyoftheT7RNAPolymerasegeneunderthecontrolofthelacUV5promoter.ThesestrainsaresuitableforproductionofproteinfromtargetgenesclonedintoT7-drivenexpressionvectors.OverExpressC41(DE3),C41(DE3)pLysS,C43(DE3),andC43(DE3)pLysSarealsodeficientinthelonandompTproteases.
OverExpressC41(DE3)pLysSandC43(DE3)pLysSalsocarryachloramphenicol-resistantplasmidthatencodesT7lysozyme,whichisanaturalinhibitorofT7RNApolymerase.CellscontainingpLysSproduceasmallamountofT7lysozyme.ThesestrainsareusedtosuppressbasalexpressionofT7RNApolymerasepriortoinduction,thusstABIlizingrecombinantsencodingparticularlytoxicproteins.
FAQWhichOverExpresscellstrainshouldIuse?
ItisdifficulttopredictwhichofthefourOverExpressstrains–C41(DE3),C43(DE3),C41(DE3)pLysS,orC43(DE3)pLysS–willworkbestinexpressingagivenprotein.WerecommendinitiallyusingtheOverExpressComboPack™whichcontains3reactionseachofthefourOverExpresscompetentcellstrains,todeterminewhichoneisbestforyourapplication.TheOverExpressstrainsareavailableaselectrocompetentorchemicallycompetentcells.
Becausetherearenointrinsicantibioticresistances(orplasmids)ineitherC41(DE3)orC43(DE3),thestrainscanbedifferentiatedfromeachotherandfromBL21(DE3)bytransformationwithastrainverificationvector,pAVD10.pAVD10containstheuncFgene(encodingthebeta-subunitofE.coliATPase)underthecontroloftheT7promoter.ThisplasmidislethaltoBL21(DE3)andtoinducedC41(DE3),butitistoleratedbyC43(DE3)regardlessofinduction.pAVD10isprovidedwithOverExpressCells.
ORDERINFORMATION
EachOverExpresskitcontainsElectrocompetentorChemicallyCompetentCellsinSOLOpackaging(1transformationpertube),ExpressionRecoveryMedium(lactoseminus),pUC19PositiveControlPlasmid,pAVD10VerificationPlasmid,andcompleteprotocols.ComboPackscontain3reactionseachofchemicallycompetentC41(DE3),C43(DE3),C41(DE)pLysS,andC43(DE3)pLysS.ebiomall.com
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但严格来说,还是有区别的。因为基因的表达产物包括蛋白质和RNA(rRNA和tRNA)。如果产物是蛋白质,就是转录翻译;如果产物是RNA,就只是转录过程,没有翻译过程。
最近导师要求做一个关于PARP家族蛋白在肝癌和癌旁组织中转录以及表达情况的初步研究,以确定目前的课题是否有很大价值。我之前一直在做湿实验,没有生信背景,所以对这个工作比较头疼。我不会编程,所以直接上网查找有没有可以在网上直接进行分析的网站。我一开始是上cbioportal上对肝癌的mRNA转录谱进行分析,但网站里面提供的对照是一个所谓的标准正常人。我没查到这个所谓的标准正常人是什么,而且导师说肝癌可能存在个体差异,所以要求用肝癌及其对应的癌旁组织的转录谱和表达谱进行分析。我上GEO搜索癌旁组织(paracanceroustissue),根本什么想要的结果都没有。我现在完全是一头雾水,无从下手,希望有做相关领域工作的前辈们或是做与之类似的工作的前辈们提供指导,非常感谢!
转录后要进行加工,转录后的加工包括: 几乎全部的真核 mRNA 端都具“帽子”结构。虽然真核生物的mRNA的转录以嘌呤核苷酸三磷酸(pppAG或pppG)领头,但在5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸(m7GpppAGpNp)。mRNA 5’端的这种结构称为帽子(cap)。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。
mRNA的帽结构功能:①能被核糖体小亚基识别,促使mRNA和核糖体的结合;②m7Gppp结构能有效地封闭RNA 5’末端,以保护mRNA免疫5’核酸外切酶的降解,增强mRNA的稳定性。 (postranslational processing):从核糖体上释放出来的多肽需要进一步加工修饰才能形成具有生物活性的蛋白质。翻译后的肽链加工包括肽链切断,某些氨基酸的羟基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等。真核生物在新生手肽链翻译后将甲硫氨酸裂解掉。有一类基因的翻译产物前体含有多种氨基酸顺序,可以切断为不同的蛋白质或肽,称为多蛋白质(polyprotein)。例如胰岛素(insulin)是先合成86个氨基酸的初级翻译产物,称为胰岛素原(proinsulin),胰岛素原包括A、B、C三段,经过加工,切去其中无活性的C肽段,并在A肽和B肽之间形成二硫键,这样才得到由51个氨基酸组成的有活性的胰岛素。向左转|向右转
请教各位,我是做在体实验,在体给予刺激30分钟后观察蛋白的表达变化,结果是蛋白表达升高,但有人质疑30分钟这么短的时间能否真的引起蛋白表达的明显变化,所以请教各位,一般蛋白从转录到表达需要多长时间?
遗传物质的表达的产物是:蛋白质
DNA转录的产物是:mRNA
希望对你有帮助~
应用高通量技术进行转录组测序是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。mRNA的转录本表达分析,通过获得研究对象基因组转录区域的信息,鉴定转录发生位点,可变剪切等,其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。
大家好,本人实验小白一枚,目前在寻找自己的毕业课题,有个实验问题想请教论坛里面的各位大侠。前期的实验证明某个转录因子具有抑癌作用,在正常肝脏组织中高表达,在肝癌组织中低表达,在HepG2,SMMC-7721等肝癌细胞株中缺失表达。我现在想用染色质免疫共沉淀结合高通量测序的方法筛选它的下游基因,由于在肝癌细胞株中缺失表达,我可以构建一个过表达转录因子的质粒到肝癌细胞株中做染色质免疫共沉淀吗?或者还有更好的方法筛选下游基因吗?谢谢!
单等位基因表达(monoallelicgeneexpression)是指在二倍体生物的细胞中一个基因的全部转录本均来自一个等位基因的现象。群体水平的细胞表达谱分析(bulkanalysis)表明,印记效应与等位基因间的相互抑制作用是产生单等位基因表达的两种可能的机制。由于群体水平的分析可能低估了单细胞内单等位基因表达的普遍程度,单细胞水平的研究可以更加全面地揭示细胞内的单等位基因表达现象。
中国科学院遗传与发育生物学研究所多个课题组以水稻叶肉细胞为对象,合作研究并揭示了植物中存在广泛的单等位基因表达。焦雨铃研究组将单细胞转录组的测定技术(single-cellRNA-seq)应用于植物细胞,并成功获得了两个水稻亚种(93-11和Nipponbare)及其正反交后代(F1)的叶肉细胞的单细胞表达谱。钱文峰和王秀杰研究组利用93-11和Nipponbare亚种之间的单核苷酸多态性估计出F1细胞中两个等位基因的表达量。通过比较等位基因的表达量,定义出细胞中单等位基因表达的基因。结果表明,单个细胞中约三分之二的基因是单等位基因表达的。进一步研究发现,等位基因表达的独立性和随机性能够很好地解释细胞中单等位基因表达的现象。该研究在单细胞水平上揭示了单等位基因表达现象的普遍性和可能的机制,为进一步研究细胞内基因表达调控规律奠定了基础。
上述研究成果于2017年9月23日在线发表于ScienceBulletin(DOI:10.1016/j.scib.2017.09.011)。焦雨铃研究组已毕业的博士生韩莹莹和钱文峰研究组的博士生楚霄为该文章的共同第一作者。焦雨铃和钱文峰为该文章的共同通讯作者。王秀杰研究员参与了课题合作。该研究得到了科技部973项目、中组部“万人计划”和植物基因组学国家重点实验室的资助。
图:水稻叶肉细胞呈现出广泛的单等位基因表达
这个词表示“将思想文字化”或是“用本国语言将外语抄写、誊录”
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