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Lucigen/Expresso® T7 Cloning and Expression System, C-His/49002-1/5 rxns
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Lucigen/Expresso® T7 Cloning and Expression System, C-His/49002-1/5 rxns
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LGC
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49002-1
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CloneandexpressevendifficultproteinswiththefastestandeasiestdirectionalPCR-basedcloningsystemavailable.
  • Savetime!Enzyme-freecloninginsecondswithcloning-readyvectorandcells.
  • Highefficiency:›90%recombinants.
  • Tightly-controlledexpressionofN-orC-terminal6xHistaggedproteins.

AlsoavailablewithcleavableSUMOSolubilityTag

CompleteCloningandExpressionSystem

TheExpressoT7CloningandProteinExpressionSystemsaredesignedforfast,easy,andefficientdirectionalcloningandexpressionofPCR-amplifiedgenes.Thesystemsarecompletewithpre-processedpETite™N-orC-Hiscloningvectors,andtwocompetentcelllines,suppliedinsingletransformationvials.HighefficiencyHI-Control™10GChemicallyCompetentCellsenablestablecloningandHI-ControlBL21(DE3)CompetentCellsprovidetightlycontrolledproteinexpression,thushelpingyouavoidexpressionproblemsseenwithleakyT7promoter-basedsystems.TheN-orC-terminal6xHistaggedproteinscanberapidlypurifiedusingstandardNichromatography.SystemsarealsoavailablethatencodeanN-terminal6xHisSUMOtagfusionforimprovedsolubilityofexpressedprotein.OtherExpressoSystemsareavailablewhichexpressproteinsunderthecontroloftheRhamnosepromoter.

Five-SecondDirectionalCloningofPCR-AmplifiedGenes

TheExpressoT7CloningandProteinExpressionSystemusesExpressioneeringTechnology™,anenzyme-freerecombinationalcloningstrategytoseamlesslyintegratethegenewiththevector.ThetargetgeneisamplifiedbyPCRusingprimersthatadd18base-pairsofvector-complementarysequencetobothendsofthegene.Unlikeotherrestrictionenzymebasedmethodsorligase-freecloningmethods,nofurthercleanuporenzymatictreatmentofthePCRproductisnecessary.Simplymix1µloftheunpurifiedPCRreactionwiththesuppliedpre-processedpETite™T7expressionvector,andtransformimmediatelyintotheHI-Control™10GChemicallyCompetentCellsprovided(Figure1). 

Expresso saves you a day!


Cloning-ReadyVectorsSaveHoursofResearchTime.

NewpETiteT7vectorsinclude:

  1. StrongT7promoterforhigh-levelexpression.
  2. ChoiceofN-terminalorC-terminal6xHisfusiontagsforfastproteinpurification.
  3. Smallsize(2.2kb)foreasierdownstreammanipulation.
  4. PatentedCloneSmart®technologyincreasescloningefficiency.

pETite vector maps

Figure2.pETiteT7expressionvectors:Smallsize(2.2kbvs.5.4kbforpET)foreasiermanipulation,includingtargetedmutagenesis.Vectorsarepre-processedforinstantenzyme-freecloningofPCRproductswithachoiceofamino-terminalorcarboxyl-terminalfusionof6xHistagtoproteinofinterest.

HighcloningefficiencywithHI-Control10GChemicallyCompetentCells.

ThehightransformationefficiencyofHI-Control10GChemicallyCompetentCellsensuresrecoveryofcloneswithprecisejunctionsandthecorrectorientation.Formostgenes,>90%ofcolonieswillhavethetargetgeneinsertedinthecorrectorientation.(Figure3).

High cloning efficiency with Expresso T7 System

Figure3.HighcloningefficiencywithExpressoT7System.
Pre-processedpETiteC-Hisvectorwasmixedwith1µlofunpurifiedPCRgeneproductandtransformedintoHI-Control10GChemicallyCompetentCells.ColonyPCRwasperformedon18randomlychosencolonies;17of18containedinsertofthecorrectsize.

HI-ControlBL21(DE3)CellsControlLeakyProteinExpression

HI-ControlBL21(DE3)CellscontainhighlevelsoflacrepressortomaintaintightcontroloverexpressionofT7RNApolymerase.Tightercontrolmeansbettertoleranceofpotentiallytoxicgeneproducts(Figure4).

Expresso vs. pET28a

Figure4.ExpressionofvariousproteinsusingtheExpressoT7SystemversusapETVector.GenesencodingaDNApolymerase,abluefluorescentprotein(BFP),orATPsynthasebsubunit(membraneprotein)wereclonedintopET28aorpETitevectorswithN-terminalorC-terminal6xHistags(asindicated).pET28aclonesweretransformedintostandardBL21(DE3)cells,andpETiteclonesweretransformedintoHI-ControlBL21(DE3)cellsforexpression.CulturesweregrowninLBat37°CtoanOD600of0.5to0.7(odd-numberedlanes)andinducedfor3hourswith1mMIPTG(even-numberedlanes).CellswerepelletedandlyseddirectlyinSDS-PAGEloADIngbuffer,and0.05ODequivalentswereanalyzedbygelelectrophoresis.ThegelwasstainedwithCoomassieblue.

PurificationofActiveSolubleFluorescentProteinUsing6xHisTag

TheN-orC-terminal6xHistaggedproteinsexpressedusingtheExpressoT7CloningandExpressionSystemcanberapidlyaffinity-purifiedovercommerciallyavailablenickelresins.Anexampleofthepurificationofa6xHistaggedyellowfluorescentproteinclonedandexpressedusingtheExpressoT7SystemisshowninFigure5. 

Expression and purification of active soluble fluorescent protein.

Figure5.Purificationofa6xHistaggedfluorescentprotein.HI-ControlBL21(DE3)cellsharboringpETiteC-Hisvectorcontainingayellowfluorescentprotein(YFP)geneweregrownat37°CinLBmediatoanOD600of0.6(lane1),theninducedwith
1mMIPTGfor4hours(lane2). Cellswereharvestedandlysedbysonicationin300mMNaCl,50mMTris-HClpH8.0.ClearedlysatewasloadedontoanNi-NTASepharose®Column.Columnflow-through(lane3,FT)andwash(lane4,W)fractionswerecollected.TheboundYFP,showninthecolumnatleft,waselutedwithwashbuffercontaining300mMimidazole(lanes5-12,E1-E8).Fluorescentfractionsalignwiththepureproteinasshownonthegel.

ImportantProductUseInformation:
ThisproductisthesubjectofU.S.Patent#6,709,861.AdditionalpatentapplicationsownedbyLucigenCorporationarepending.

The6xHistagislicensedfromHoffmann-LaRoche,Inc.,Nutley,NJand/orHoffmann-LaRocheLtd.,Basel,Switzerlandandisprovidedonlyfortheuseinresearch. InformationaboutlicensesforcommercialuseisavailablefromQiagenGmbH,QIAGENStrasse1,D-40724Hilden,Germany.Purificationofthe6xHistaggedproteinswithNi-NTAmanufacturedbyQIAGENishighlyrecommendedforbestperformancesandtoavoidpoorpurificationresults.

ORDERINFORMATION

TheExpressoT7Cloning&ExpressionSystemcontainspre-processedpETite®N-Hisand/orpETiteC-HisVectorDNA,HI-Control™10GChemicallyCompetentCellsforcloning,andHI-ControlBL21(DE3)ChemicallyCompetentCellsforproteinexpression.AlsoincludedareN-Hisand/orC-HisPositiveControlInsertDNAs,andtransformationpositivecontrolpUCDNA.

TheExpressoT7SUMOCloningandExpressionSystemcontainspre-processedpETite®N-HisSUMOVectorDNA,HI-Control™10GChemicallyCompetentCellsforcloning,andHIControlBL21(DE3)ChemicallyCompetentCellsforproteinexpression.AlsoincludedareSUMOPositiveControlCInsertDNA,transformationpositivecontrolpUCDNA,SUMOExpressProtease,SUMOCleavageControlProtein,andforwardandreversePCRprimerstoconfirmclones.

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小鼠被广泛用于模拟人类代谢、疾病和药物应答,是医学研究中的一个基本工具。然而斯坦福大学的研究团队指出,人类和小鼠的基因表达存在着惊人的差异,不论是蛋白编码基因还是非编码基因。这项研究发表在十一月十七日的美国国家科学院院刊PNAS杂志上。Michael Snyder及其同事在15种组织中比较了人类和小鼠的基因表达情况,包括大脑、心脏、肝脏、肾脏等等。他们发现,物种间的基因表达差异要大于组织间的差异。举例来说,小鼠肝脏与人类肝脏基因表达的相... 查看更多>
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都说熬夜对身体的损害很大,但是仍然有很多“夜猫子”不顾自己的身体健康继续熬夜。大部分人以为偶尔熬夜一次,第二天多休息会儿对健康的影响不大,可事实真的是这样吗?科学证明,“夜猫子”付出的代价远比我们所认知的还要多。Uppsala 大学的 Cedernaes 教授率领他的中国、德国和悉尼同事们对所谓“偶尔一次”的熬夜进行了深入研究,试图阐明熬夜对身体伤害的根本机制。这个研究团队的研究表明,仅仅熬夜一晚就会引发组织特异性的表观遗传、基因表达定... 查看更多>
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细菌引起许多严重疾病,如食物中毒和肺炎。科学家们面临的挑战是,引起疾病的细菌是非常有弹性的。比如,当诸如大肠杆菌之类的细菌经历饥饿时,它们会大规模地重新组装它们的 查看更多>
以前只要提到基因表达分析,人们就会想到荧光定量PCR;只要提到高通量基因表达分析,人们会首先想到基因芯片。虽然荧光定量PCR仪几乎每个实验室都有,但是做芯片就不一定每个实验室都具备这个条件了。 查看更多>
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我请请教一下,如何验证一个转录因子在细胞内是否表达。我将细胞抽提RNA,逆转录后扩出该转录因子的基因,是否就可以表明该转录因子在该细胞内是表达的?因为是菜鸟,很多都不懂。请各位多多指教,不胜感激。
고려해운123
qiouxianan2021-08-02
一般来说,是一个意思。因为大部分产物都是蛋白质,所以一般来说二者含义相同。
但严格来说,还是有区别的。因为基因的表达产物包括蛋白质和RNA(rRNA和tRNA)。如果产物是蛋白质,就是转录翻译;如果产物是RNA,就只是转录过程,没有翻译过程。
某种转录因子有四种不同的亚型(N1N2N3N4),我想检测它们在某种细胞内的表达情况,能不能提取这种细胞的蛋白,然后跑western,通过敷育四种对应的抗体最后来确认哪种亚型表达得多,哪种亚型表达得少呀?我做了三次western,结果在对应的分子量区域都没有呈现条带出来!有前辈说这样做是无意义的,因为细胞可能对不同抗体的敏感性不同,所以跑western时用一种样本分别敷四种抗体的话是没有可比性的。真的是这样吗?我看文献里也有人做不同蛋白亚型在组织中的表达,他们能做出来条带。求各路大神指点啊!(抱拳)
蛋白质在细胞中的丰度变化很大程度上决定了不同组织如脑和肌肉,以及健康和不健康人类细胞之间的差异。长期以来人们都认为转录,这一控制遗传信息从DNA流向RNA的过程,对决定细胞内蛋白质的数量起主导作用。但在过去的十年里,有许多的研究则提出RNA翻译为蛋白质的速度差异是一个更为重要的因素。
近期发表在《科学》(Science)以及其他杂志上的一些新研究证实,转录实际上是决定蛋白质丰度中最具影响力的步骤。
例如,近期来自哈佛-麻省理工Broad研究所的Marko Jovanovic等在Science杂志上发表文章,称检测了处于稳定状态和响应细菌脂多糖(LPS)时的小鼠骨髓树突细胞。他们发现在稳定状态时,mRNA水平、翻译速度和蛋白质降解速度可分别解释68%、26%和8%的蛋白质表达差异。当用LPS刺激细胞时,mRNA水平似乎可以解释90%的蛋白质表达差异,而翻译和蛋白质降解只能解释4%和6%的差异。Jovanovic等发现,在LPS处理的情况下,核糖体、线粒体以及其他一些高表达管家蛋白的翻译和蛋白质降解速度发生了更多改变,表明这两个步骤在控制一些过程中发挥了重要的作用。
来自加州大学洛杉矶分校统计学和人类遗传学助理教授Jingyi Jessica Li,和劳伦斯伯克利国家实验室的Mark Biggin,则在PeerJ杂志的一篇论文中用两种方法重新分析了2011年一项Nature研究的数据,说明了一些检测错误。他们证实采用第一种方法结果表明mRNA水平差异可以解释最小56%的蛋白质水平差异,而第二种方法表明mRNA水平可以解释84%的蛋白质表达差异,其中转录占73%,RNA降解占11%,而翻译和蛋白质降解各自仅占8%。
在3月6日,发表在Science杂志上的一篇题为“Statistics requantitates the central dogma”的文章中,Li和Biggin综述了上述这些近期的研究,得出了转录是蛋白质丰度最大贡献者这一结论。他们认为,他们自身以及近期其他一些研究工作都采用了更细致的统计学方法,来评估或是减少了实验性检测错误。Li和Biggin认为,早期的一些研究得到的有关翻译影响的结果实际上是由于实验错误所导致。
研究人员提出,科学家们精确地模拟基因表达需要采用更准确的测量和分析方法。他们的研究对于鉴别出可以有效治疗各种疾病的药物具有重要的影响。
原文链接:Statistics requantitates the central dogma
Dynamic profiling of the protein life cycle in response to pathogens
本人最近在用双向电泳技术研究一种细菌(H)不同血清型的两个菌株(H1和H2)的分泌蛋白差异,结果经双向电泳筛选出一些差异蛋白。之后挑取其中二个差异蛋白利用实时荧光定量PCR相对定量方法分析其转录水平。结果发现这两个蛋白在菌株H1的表达量远低于在菌株H2的表达,但是荧光定量PCR分析发现这两个蛋白的转录水平菌株H1是菌株H2的五十倍,现在正为此事烦恼,哪位高人能给些指点呢?
我想研究转录因子A对B物质表达有无影响,先构建转录因子A的真核表达载体和含B物质全长启动子区的荧光素酶报告质粒,那么转染时细胞是否加1.A表达载体 2.B荧光素酶报告质粒 3.作为reference的内参质粒?请教有哪位高手做过?可以这么做吗?
转录组分析概述123
杀生丸EIO2018-02-26
转录组是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下,细胞内所有转录的mRNA产物的集合,包含了时间和空间的限定,是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。转录水平的调控是目前研究最多的,也是生物体最重要的调控方式。
  应用高通量技术进行转录组测序是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。mRNA的转录本表达分析,通过获得研究对象基因组转录区域的信息,鉴定转录发生位点,可变剪切等,其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。
Taqman设计总结 123
蒙塔基的钢蛋儿2021-07-28

如题,我现在做出了一个蛋白相对于正常组织,在肿瘤里表达升高。想做某转录因子调控它的表达。查了转录因子预测的网站,每个预测的都很不一样,而且参与其调控的转录因子有几十个。我该怎么办呢?用什么实验技术或者方法能找到一个能做的呢?

基因转录是指DNA分子转录成RNA
翻译是指mRNA在核糖体的帮助下翻译成肽链
基因表达则是二者的统一,即DNA转录成RNA,RNA翻译成肽链,并最终折叠成有意义的蛋白质
不一样。
基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。
即表达=转录+翻译
转录量和拷贝数是相等的(产生的RNA),但和表达量(蛋白质,最终产物)不同意思,只是表达的第一步,只有转录的也都同样顺利翻译成蛋白质才有同时满足的可能。
转录增加 不等于 表达增加表达增加 也不等于 转录增加成功转录 不代表 成功表达成功表达 说明 成功转录
是的,必须,rna病毒需要逆转录成DNA之后进行这个步骤,朊病毒需要逆转两次之后进行。但是注意这是必须的两步,不是只有两步。
品牌问答

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