- Fast:5-second,directionalcloningwithnoenzymeincubations,ligation,orvectorprep.Watchvideo»
- Precise:"Noscar"vectorresultsinhighlyaccuratesequencesandcorrectproteins.
- SmallVector:3.4-kbvectorgiveshightransfectionefficiency&easydownstreammanipulation.
- Robust:CMVpromoterprovidesstrong,constitutiveeukaryoticexpression.
TheExpresso®CMVCloningandExpressionSystemcombinesinstant,enzyme-free,directionalcloningwitha“noscar”vectorforeukaryoticgeneexpression.ThiscloningsystemisbasedonExpressioneering™Technology,whichusesinvivohomologousrecombinationtoseamlesslyclonePCR-amplifiedDNAintospeciallydesignedexpressionvectorswithoutpurificationorenzymaticincubations.It’sthefastest,easiestmammalianexpressionsystemavailable.
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| Figure1.ExpressioneeringTechnologyusesinvivohomologousrecombinationtoseamlesslyclonePCR-amplifiedDNAintothepME-HAvector.Targetgenesareamplifiedwithprimersthatinclude18basesofoverlapwiththeendsoftheExpressovector.TheunpurifiedPCRampliconissimplymixedwiththepME-HAexpressionplasmidandimmediatelytransformedintothehighlycompetentcellsprovided.NoDNApurification,enzymetreatment,vectorpreparation,orligationstepsarerequired. |
pME-HAVector
TheExpressoCMVCloningandExpressionSystemfeaturesthepME-HAexpressionvector,whichcontainsalltheelementsyouneed,andnothingyoudon't.TheCMVpromoterenablesstrong,constitutiveexpressioninthesmallestmammalianexpressionvectoravailable.The3.4kbvectorsupportshighertranfectionefficiencyandeasierdownstreammanipulation.CombinedwithExpressioneeringtechnologyforinstant,scar-freecloning,theresultissurprisinglysimplemammalianexpression.
 | Figure2.pME-HAexpressionvectorTheCMVpromoterdrivesexpressionofthePCRinsert;ampandSV40promotersexpressthegeneforkanamycin/neomycinresistanceinbacteriaandmammaliancells.ThepUCorigingiveshighplasmidyields.CloneSmart®transcriptionterminators(T)preventtranscriptionintooroutofthevectorbackbone,increasingclonestABIlity.TheHAaffinitytagcanbefusedtothecarboxyterminusoftheexpressedprotein,ifdesired. |
StrongExpression
ThepME-HAvectorprovidesrobustproteinexpression,greaterthanorequaltothatofthecommonly-usedvectorpCDNA3.1.ProteinexpressionfromtheGFPgene(0.8kb)andthefulllengthβ-galactosidasegene(3kb)wasdetectedbyWesternblottingagainsttheHAtaginCHO-K1andCOS-7transfectants(Figure3).β-galactosidaseexpressionwasalsomeasuredquantitativelyintransfectedCHO-K1cells(Figure4).
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| Figure3.ComparisonofproteinexpressionfrompME-HAandpcDNA3.1vectorsinCHOandCOScells.CHOandCOScellsweretransfectedwithconstructsencodingGreenFluorescentProtein(GFP)andbeta-galactosidase(β-gal)usingLipofectamine2000(Invitrogen)followingthemanufacturer'srecommendation.At48hposttransfection,wholecelllysateswerefractionatedbySDSPAGE,transferredtoaPVDFmembrane,anddetectedwithanti-HAantibody.ExpressionfromthepME-HAvectorwasequaltoorgreaterthanthatfromthe“standard”pcDNA3.1vector. |
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| Figure4.CHO-K1cellsweretransfectedwithpME-HA-Bgal plasmidataratioof2:1(µlTransIT-2020transfectionreagent:µgDNA).CellswereassayedforBgalactivity24-hourspost-transfectionusingtheMammalianB-GalactosidaseAssayKit(ThermoScientific,#75707),andreadat405nmonaplatereader.Absorbancevaluesweredividedbybackgroundabsorbance(mock-transfectedcells). |
ExpressionofDifficultProteins
TheuseofExpressioneeringtechnologyresultsinprecisecloning,withouttheadditionofunwantedsequence(suchasrestrictionsites)typicallypresentinmultiplecloningsites.TheminimalsizeofthepME-HAvectoralsocontributestoenhancedcloningcapability.NumerousGPCRgeneshavebeenclonedandexpressedinmammaliancellsusingtheExpressoCMVsystem.WesternblottingwasusedtodetectexpressionoftheHA-taggedGPCRs(Figure5),andfunctionalitywasconfirmedbyrADIoactiveligandbindingassays(Figure6).
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| Figure5.ExpressionofGPCRsfromthepME-HAvector.COS-7cellsweretransfectedwithconstructsencodingturkeybeta1-adrenergicreceptor(β1-AR)andhumanadenosineA1receptor(A1A)withTransIT-2020(MirusBioLLC)orLipofectamine2000(Invitrogen)followingmanufacturer'srecommendation.At48hourspost-transfection,wholecelllysateswerefractionatedbySDS-PAGE,transferredontoPVDFmembrane,anddetectedwithanti-HAantibody. |
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| Figure6.RadioligandbindingdataforGPCRsexpressedfromthepME-HAvector.Cellsexpressingb1-ARwereanalyzedforradioligandbindingusing20nM[3H]-Dihydroalprenolol(Perkinelmer).Non-specificbindingwasdeterminedinpresenceofexcessunlabeledcompetitor,10μM(S)-(-)-Propanololhydrochloride.ReceptorboundligandwascapturedonGF/Bfiltersandcounted.CellsexpressingA1Areceptorwereanalyzedbybindingof10μM[3H]-DPCPX(PerkinElmer).Non-specificbindingwasdeterminedinpresenceofexcessunlabeledcompetitor,10μM8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine.BoundligandwascapturedonGF/Bfiltersandcounted. |
ORDERINFORMATION
TheExpressoCMVCloning&ExpressionSystemcontainspre-processedpME-HAVectorDNA,single-transformationE.cloni10GChemicallyCompetentCells(SOLOs),andrecoverymedium.Alsoincludedareβ-galactosidasepositivecontrolinsertDNA,transformationpositivecontrolpUCDNA,andforwardandreversePCRprimerstoconfirmclones.ebiomall.com
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单等位基因表达（monoallelicgeneexpression）是指在二倍体生物的细胞中一个基因的全部转录本均来自一个等位基因的现象。群体水平的细胞表达谱分析（bulkanalysis）表明，印记效应与等位基因间的相互抑制作用是产生单等位基因表达的两种可能的机制。由于群体水平的分析可能低估了单细胞内单等位基因表达的普遍程度，单细胞水平的研究可以更加全面地揭示细胞内的单等位基因表达现象。
中国科学院遗传与发育生物学研究所多个课题组以水稻叶肉细胞为对象，合作研究并揭示了植物中存在广泛的单等位基因表达。焦雨铃研究组将单细胞转录组的测定技术（single-cellRNA-seq）应用于植物细胞，并成功获得了两个水稻亚种（93-11和Nipponbare）及其正反交后代（F1）的叶肉细胞的单细胞表达谱。钱文峰和王秀杰研究组利用93-11和Nipponbare亚种之间的单核苷酸多态性估计出F1细胞中两个等位基因的表达量。通过比较等位基因的表达量，定义出细胞中单等位基因表达的基因。结果表明，单个细胞中约三分之二的基因是单等位基因表达的。进一步研究发现，等位基因表达的独立性和随机性能够很好地解释细胞中单等位基因表达的现象。该研究在单细胞水平上揭示了单等位基因表达现象的普遍性和可能的机制，为进一步研究细胞内基因表达调控规律奠定了基础。
上述研究成果于2017年9月23日在线发表于ScienceBulletin(DOI:10.1016/j.scib.2017.09.011)。焦雨铃研究组已毕业的博士生韩莹莹和钱文峰研究组的博士生楚霄为该文章的共同第一作者。焦雨铃和钱文峰为该文章的共同通讯作者。王秀杰研究员参与了课题合作。该研究得到了科技部973项目、中组部“万人计划”和植物基因组学国家重点实验室的资助。
图：水稻叶肉细胞呈现出广泛的单等位基因表达
最近导师要求做一个关于PARP家族蛋白在肝癌和癌旁组织中转录以及表达情况的初步研究，以确定目前的课题是否有很大价值。我之前一直在做湿实验，没有生信背景，所以对这个工作比较头疼。我不会编程，所以直接上网查找有没有可以在网上直接进行分析的网站。我一开始是上cbioportal上对肝癌的mRNA转录谱进行分析，但网站里面提供的对照是一个所谓的标准正常人。我没查到这个所谓的标准正常人是什么，而且导师说肝癌可能存在个体差异，所以要求用肝癌及其对应的癌旁组织的转录谱和表达谱进行分析。我上GEO搜索癌旁组织（paracanceroustissue），根本什么想要的结果都没有。我现在完全是一头雾水，无从下手，希望有做相关领域工作的前辈们或是做与之类似的工作的前辈们提供指导，非常感谢！
如题，我现在做出了一个蛋白相对于正常组织，在肿瘤里表达升高。想做某转录因子调控它的表达。查了转录因子预测的网站，每个预测的都很不一样，而且参与其调控的转录因子有几十个。我该怎么办呢？用什么实验技术或者方法能找到一个能做的呢？
表达谱差异分析(differential expression profiling)主要包括基因表达谱(gene expression profiling) 和蛋白质表达谱(protein expression profiling) 。大规模表达谱分析已经成为认识疾病分子机制的有利方法,在癌症研究等方面取得了一定的进展。成功的表达谱分析基于实验及其过程分析的有机结合。实验过程从关注的疾病开始,首先收集大量的疾病相关组织样本,样本数量可从10 多个到数百个,但必须足以对每一组织类型及个体差异进行比较分析,而且许多情况下不能仅简单地分为正常和疾病组织。例如,在对糖尿病的研究中,所收集的样本来自健康人、胰岛素耐受和糖尿病病人的不同试验阶段,如胰岛素治疗前后。样品还应包括其他器官的取材,以便进行基因表达的组织分布研究。为了便于对后来的实验数据进行分析管理,需采集并储存所有的组织样本和临床参数。接下来进行组织样本的处理,利用生物芯片(寡核苷酸芯片、cDNA 芯片或全基因组芯片) 进行表达谱测定,并进行生物信息学分析。
通常,表达谱的分析结果需进一步的实验加以证实。定量RT2PCR 是最灵敏的确证方法,该方法还可以将确证实验的范围扩大到原测组织以外的更广泛的组织和组织类型,揭示基因表达的组织分布情况。
确证实验揭示了疾病相关基因。据此,可以进行进一步研究,探索这些基因的功能,开发新的治疗手段。例如,对于正常和疾病组织中表达有显著性变化的基因,可以进行新治疗靶点的鉴定和确定研究,或利用实验和分析工具研究分析其功能;对于疾病组织中活性升高的酶,可以当作前药活化酶进行鉴定研究。典型的表达谱能够显示疾病过程中有大量的已知基因表达的改变,而许多已知基因的代谢通路、表达产物酶学分类和蛋白质功能业已发表,将两者对照分析,可以鉴定出酶活性,选择其中可能成为前药活化酶的部分进行进一步研究;对于疾病特异的蛋白质,可以进行抗原表型分析,决定疫苗的开发策略。
寻找差异表达基因的方法除芯片技术外,一些新的检测方法如差异显示PCR ( differential display PCR, DD－PCR) 、消减杂交( suppression subreactive hy bridization , SSH) 等也相继得到结合应用。
最近导师要求做一个关于PARP家族蛋白在肝癌和癌旁组织中转录以及表达情况的初步研究，以确定目前的课题是否有很大价值。我之前一直在做湿实验，没有生信背景，所以对这个工作比较头疼。我不会编程（只有很浅薄的R基础），而且没有统计学基础，所以直接上网查找有没有可以在网上直接进行分析的网站。我一开始是上cbioportal上对肝癌的mRNA转录谱进行分析（我只会看网站上红得蓝的表达上调下调的标记，不会看zscore什么的。。。），但网站里面提供的对照是一个所谓的标准正常人。我没查到这个所谓的标准正常人是什么，而且导师说肝癌可能存在个体差异，所以要求用肝癌及其对应的癌旁组织的转录谱和表达谱进行分析。我上GEO搜索癌旁组织（paracanceroustissue），根本什么想要的结果都没有。我现在完全是一头雾水，无从下手，希望有做相关领域工作的前辈们或是做与之类似的工作的前辈们提供指导，非常感谢！
遗传物质的表达的产物是：蛋白质
DNA转录的产物是：mRNA
希望对你有帮助~
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