...克隆与功能研究及低温胁迫下棉花蛋白质差异表达分析
干旱等非生物胁迫因素导致作物在形态、生理、生物化学及细胞水平上产生一些不利于其生长的反应，严重地阻碍着现代农业的发展。随着全球气候变暖和人类活动加剧，干旱有明显加重的趋势。棉花生产是纺织工业及国防建设的重要物质基础，也是中国农业重要组成部分，对中国国民经济的发展有着重要的影响，而且在世界棉花贸易市场上也起着举足轻重的作用。但是，每年由于旱灾引起的棉花年减产量达总量的30%以上，干旱已经成为限制棉花生产的首要非生物因素，实践证明采用传统的育种手段很难解决这一问题，因此，克隆抗旱基因并采用基因工程的方法培育抗旱新品种具有十分重要的意义。
MYB转录因子广泛的分布于植物、动物和真菌中，第一个被鉴定出来的MYB转录因子与细胞周期相关，MYB家族成员众多，与次级代谢的调节、细胞形态控制、细胞周期及信号转导等有关植物MYB类转录因子是转录因子最大家族之一，以含有MYB结构域为共同特征。棉花是较为耐旱的作物，其基因组中可能蕴藏着大量与抗旱相关的基因，但由于棉花基因组较为复杂，对耐旱基因的挖掘较少，棉花抗旱的机理尚不清楚，需要进行深入的研究。
中国农业科学院棉花研究所立题《一个亚洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析》，该研究克隆了亚洲棉MYB家族的一个新基因，通过对其序列及其响应PEG6000胁迫表达规律的分析，为进一步研究其功能，探索亚洲棉MYB家族基因的抗旱机制奠定基础。
为了研究GaMYB2在亚洲棉石系亚1号中的抗旱表达特征，提取经17%PEG6000处理不同时间的3叶期幼苗根部进行Real-timePCR检测（图8）。从图中可以看到，胁迫处理后GaMYB2的相对表达量较对照（0h）有明显的提高，在3h时根部基因的表达量显著提高，并达到最大，此后表达量逐渐回落，结果表明，GaMYB2响应PEG6000模拟的干旱胁迫，可能参与干旱胁迫防御反应。 
GaMYB2基因通过基因枪法转化洋葱表皮细胞瞬时表达分析
分别用70%乙醇和灭菌蒸馏水清洗金粉（直径为1μm），加入灭菌蒸馏水制成金粉悬浮液，取100μL放在含有1.0cm2洋葱表皮的玻璃皿中，边振荡边加入10μLpCambia2301-GaMYB2-GFP质粒，逐步加入40μL0.1mol·L-1亚精胺和100μL2.5mol·L-1CaCl2，振荡混匀。基因枪GDS-80（购自美国Wealteccorp）轰击时氦气罐的气压为1300psi，取10μLDNA包裹好的微粒悬浮液加到基因枪中央，进行轰击，之后放置25℃避光过夜培养，使用ConfocalLaser激光共聚焦显微镜观察。
采用基因枪轰击的方法，用包裹质粒的金粉对洋葱表皮进行轰击，暗培养过夜后，在激光共聚焦显微镜下进行观察（图10），从图10-A中可以看出对照GFP空载体在整个洋葱细胞均能看到绿色荧光，为组成型表达；从图10-B中发现GaMYB2-GFP的融合表达载体只能在细胞核中能看到绿色荧光，这进一步证明该蛋白不具有跨膜蛋白结构，定位在细胞核中，具有转录因子的一般特征。
干旱、盐碱、低温等环境胁迫对植物的生长和种子的形成产生了不利的影响，植物通过一系列的生化和生理过程来适应这些胁迫。MYB转录因子是植物中最大的转录家族之一，在拟南芥中已经鉴定出198个MYB家族的成员，其中一些成员如AtMYB44、AtMYB60及AtMYB61通过调控气孔的开闭帮助植物体应对干旱胁迫。
通过超表达MYB基因的试验发现，阳性植株的干旱耐受能力显著提高，这预示着MYB家族成员在改良作物抗旱方面具有很大的潜力。虽然关于MYB类基因调控抗旱作用机制的细节还不很清晰，但是，已经取得了不少进展，一般认为MYB转录因子位于ABA信号通路的下游，植物在受到干旱胁迫时，MYB与MYBR（受体）结合，激活RNA聚合酶Ⅱ转录复合物，从而直接启动调控靶基因的表达，最后通过基因产物对内外信号做出调节反应，最终引起一些生理生化反应来保护自身。植物根部特征与植物的抗/耐干旱性密切相关，根系的形成主要受土壤水分含量的影响，一般主根的生长不受水分胁迫的影响，侧根的数目受其影响较大。MYB96能够在干旱胁迫时调节ABA信号通路，使拟南芥的根系更加发达，这将有利于拟南芥在干旱胁迫时摄取更多的水分，达到保护自身的目的。
根组织不仅是接受干旱胁迫信号的主要位点，也是调控植物抗/耐干旱能力的关键部位。虽然严重的旱胁迫情况下，棉花的生长及种子的形成都会受到严重影响，但棉花还是较为耐旱的作物。为了寻找棉花抗干旱相关的关键基因，中国农业科学院棉花研究所转基因实验室对PEG6000胁迫处理亚洲棉的根组织材料进行了RNA测序分析，GaMYB2是从RNA数据中挑选一个上调表达的基因，Real-timePCR结果进一步表明GaMYB2在根中表达量最高，这说明该基因可能在根部的生长和发育及其生理活动中发挥重要作用。GaMYB2可能是棉花抗旱能力改良的重要候选基因，但是GaMYB2是否真正参与植物体干旱耐受能力的调控及其调控机理如何还有待进一步的试验研究。
从亚洲棉中克隆出MYB家族的一个新基因GaMYB2，cDNA全长1117bp，ORF长840bp，编码279个氨基酸，GaMYB2蛋白具有R2R3型MYB蛋白的一般特征。利用第三代低压手持式基因枪GDS-80快速验证了该基因在细胞核中表达，并且在根部和花中表达量较高。经PEG6000胁迫后，其表达量上调表达，3h达到最高，因此，亚洲棉受到干旱胁迫时根部该基因的表达量增加对抵御外界的干旱环境可能发挥一定作用。
杨召恩,杨作仁,刘坤,等.一个亚洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析[J].中国农业科学,2013,46(1):195-204.
MYB转录因子广泛的分布于植物、动物和真菌中，第一个被鉴定出来的MYB转录因子与细胞周期相关，MYB家族成员众多，与次级代谢的调节、细胞形态控制、细胞周期及信号转导等有关植物MYB类转录因子是转录因子最大家族之一，以含有MYB结构域为共同特征。棉花是较为耐旱的作物，其基因组中可能蕴藏着大量与抗旱相关的基因，但由于棉花基因组较为复杂，对耐旱基因的挖掘较少，棉花抗旱的机理尚不清楚，需要进行深入的研究。
中国农业科学院棉花研究所立题《一个亚洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析》，该研究克隆了亚洲棉MYB家族的一个新基因，通过对其序列及其响应PEG6000胁迫表达规律的分析，为进一步研究其功能，探索亚洲棉MYB家族基因的抗旱机制奠定基础。
模拟干旱条件下GaMYB2基因的表达分析
为了研究GaMYB2在亚洲棉石系亚1号中的抗旱表达特征，提取经17%PEG6000处理不同时间的3叶期幼苗根部进行Real-timePCR检测（图8）。从图中可以看到，胁迫处理后GaMYB2的相对表达量较对照（0h）有明显的提高，在3h时根部基因的表达量显著提高，并达到最大，此后表达量逐渐回落，结果表明，GaMYB2响应PEG6000模拟的干旱胁迫，可能参与干旱胁迫防御反应。
GaMYB2基因通过基因枪法转化洋葱表皮细胞瞬时表达分析
分别用70%乙醇和灭菌蒸馏水清洗金粉（直径为1μm），加入灭菌蒸馏水制成金粉悬浮液，取100μL放在含有1.0cm2洋葱表皮的玻璃皿中，边振荡边加入10μLpCambia2301-GaMYB2-GFP质粒，逐步加入40μL0.1mol·L-1亚精胺和100μL2.5mol·L-1CaCl2，振荡混匀。基因枪GDS-80（购自美国Wealteccorp）轰击时氦气罐的气压为1300psi，取10μLDNA包裹好的微粒悬浮液加到基因枪中央，进行轰击，之后放置25℃避光过夜培养，使用ConfocalLaser激光共聚焦显微镜观察。
采用基因枪轰击的方法，用包裹质粒的金粉对洋葱表皮进行轰击，暗培养过夜后，在激光共聚焦显微镜下进行观察（图10），从图10-A中可以看出对照GFP空载体在整个洋葱细胞均能看到绿色荧光，为组成型表达；从图10-B中发现GaMYB2-GFP的融合表达载体只能在细胞核中能看到绿色荧光，这进一步证明该蛋白不具有跨膜蛋白结构，定位在细胞核中，具有转录因子的一般特征。
讨论
干旱、盐碱、低温等环境胁迫对植物的生长和种子的形成产生了不利的影响，植物通过一系列的生化和生理过程来适应这些胁迫。MYB转录因子是植物中最大的转录家族之一，在拟南芥中已经鉴定出198个MYB家族的成员，其中一些成员如AtMYB44、AtMYB60及AtMYB61通过调控气孔的开闭帮助植物体应对干旱胁迫。
通过超表达MYB基因的试验发现，阳性植株的干旱耐受能力显著提高，这预示着MYB家族成员在改良作物抗旱方面具有很大的潜力。虽然关于MYB类基因调控抗旱作用机制的细节还不很清晰，但是，已经取得了不少进展，一般认为MYB转录因子位于ABA信号通路的下游，植物在受到干旱胁迫时，MYB与MYBR（受体）结合，激活RNA聚合酶Ⅱ转录复合物，从而直接启动调控靶基因的表达，最后通过基因产物对内外信号做出调节反应，最终引起一些生理生化反应来保护自身。植物根部特征与植物的抗/耐干旱性密切相关，根系的形成主要受土壤水分含量的影响，一般主根的生长不受水分胁迫的影响，侧根的数目受其影响较大。MYB96能够在干旱胁迫时调节ABA信号通路，使拟南芥的根系更加发达，这将有利于拟南芥在干旱胁迫时摄取更多的水分，达到保护自身的目的。
根组织不仅是接受干旱胁迫信号的主要位点，也是调控植物抗/耐干旱能力的关键部位。虽然严重的旱胁迫情况下，棉花的生长及种子的形成都会受到严重影响，但棉花还是较为耐旱的作物。为了寻找棉花抗干旱相关的关键基因，中国农业科学院棉花研究所转基因实验室对PEG6000胁迫处理亚洲棉的根组织材料进行了RNA测序分析，GaMYB2是从RNA数据中挑选一个上调表达的基因，Real-timePCR结果进一步表明GaMYB2在根中表达量最高，这说明该基因可能在根部的生长和发育及其生理活动中发挥重要作用。GaMYB2可能是棉花抗旱能力改良的重要候选基因，但是GaMYB2是否真正参与植物体干旱耐受能力的调控及其调控机理如何还有待进一步的试验研究。
结论
从亚洲棉中克隆出MYB家族的一个新基因GaMYB2，cDNA全长1117bp，ORF长840bp，编码279个氨基酸，GaMYB2蛋白具有R2R3型MYB蛋白的一般特征。利用第三代低压手持式基因枪GDS-80快速验证了该基因在细胞核中表达，并且在根部和花中表达量较高。经PEG6000胁迫后，其表达量上调表达，3h达到最高，因此，亚洲棉受到干旱胁迫时根部该基因的表达量增加对抵御外界的干旱环境可能发挥一定作用。
参考资料
杨召恩,杨作仁,刘坤,等.一个亚洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析[J].中国农业科学,2013,46(1):195-204.
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发布于 ： 2021-08-21
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