二聚体介导的体外基因表达调控

材料

试剂

本节描述的已构建的载体及雷帕霉素二聚体均来自ARIAD公司的ARGENT转录调控质粒试剂盒（www.ariad.com/regulationkits)适宜IE细胞生长的培养基

二聚体（本流程描述的二聚体的化学结构如图2所示）

雷帕霉素类似物AP21967和AP23102(ARIAD公司）

雷帕霉素（Sigma-Aldrich公司，目录号R0395)

通常此化合物为干粉，应在密封容器中避光保存于一20°C。在体外实验中，该化合物应如方法中所述以无水乙醇溶解。

乙醇（如AAPER公司乙醇，纯度100%)，冰冷的

构建的质粒（常用于建立二聚体诱导表达的载体质粒构建图谱如图4所示）

转录因子质粒：pC4N2-RHS/ZF3

质粒载体驱动受控转录因子的表达（图4,上），包含一个CMV增强子/启动子（c),用于驱动双顺反子转录的融合蛋白：

•一个活化的融合区域（RhS),由人FRAP(Rh)的FRB片段构成，融合到源于人NFkB亚单位p65的活化区域（S;第361——551位氨基酸）。FRB区域由FRAP的2021——2113位氨基酸组成，合并T2098L突变以便结合雷帕霉素类似物。

•一个080融合区域（ZF3)由ZFHD1DBD(Z)和三个串联重复的人FKBP12(F3)拷贝序列组成。

两种/融合蛋白均包含一段氨基酸端核定位序列（N2,源自人c-myc基因）。两个编码区由脑心肌炎病毒的一段核糖体结合序列（IRES)隔开，以利第二个顺反子（ZF3)的翻译，再连接一段源于兔P-珠蛋白的3’非翻译区（UTR),包含其终末内含子和polyA信号。

转录因子融合的适宜结构应能使ZFHDl融合至三个串联重复的人FKBP12区域和P65的活化区域融合至一个单一的FRB区域。理论上该结构可使每个DNA结合位点募集最多3个活化区域（图1)。

IB基因质粒：pZi2I-PL-2

被调控基因的编码区插入耙基因载体（图4,下）。载体包含12个ZFHDl结合位点和一个极小的人IL-2基因启动子（Z12I)，多接头（PU的上游为3’UTR包含一个源于SV40晚
期基因（_2)的多聚腺苷酸化信号。多接头由以下的限制性位点组成：HimUII、Pst1、EcoRI’SpeI、CZciI。

2.必要时可优化转录因子载体。

在一定的情况下，有必要以其他增强子替换帮助待调控的转录因子表达的CMV增强子,如在靶细胞群体中更活跃的增强子。方法是以所选增强子和5’UTR序列替换pC4N2_RhS/ZF3的MM-EcoRI片段。

3.必要时对载体组分进行亚克隆。

在某些应用中，期望将待调控的转录因子和靶基因盒亚克隆到供选择的载体支架中，如AAV、腺病毒、慢病毒、反转录病毒载体或包含有选择标记的载体。为达这一目的，可在适当的情况下将完整的转录因子表达盒（如运用MwI-JftoI的位点）或仅仅是编码区（如EcoRl-BamHD转移到另一个载体中。完整的靶基因盒能运用邻近5,MwI或NM和3,SamHI位点进行转移。

转录因子和靶基因盒也能合并到单一的载体中。例如，在相同的方向靶基因盒直接克隆到转录因子盒的下游的载体已成功构建并通过共转导分离的载体而保留紧密的调控水平
(Riveraetal.2005)

将载体引入靶细胞

4•运用适宜的技术将转录因子和靶基因载体引入感兴趣的靶细胞中。
瞬时转染

a.起始时将转录因子和靶基因质粒以2:1的比率引入。

b.如果转录因子的表达水平太高，瞬时转染的@基因的转录能够减少或者被压制(Natesanetal.1997)。

在给定的条件下有可能需要进一步优化质粒的比率，用DNA携带引人时要限制转录因子质粒的数量。

稳定转染

当需要稳定细胞株时（一般不出现压制的情况，见Natesanetal.1997)，引入的靶基因表达水平必须同融合的活化区域表达水平一致。驱动转录因子融合表达的增强子必须根据被转导的细胞进行优化。CMV增强子普遍适用于这一目的，但在某些细胞类型中，选择性的增强子可能更适宜，可能需要克隆到转录因子载体中（见上面的步骤2)。为建立包含转录因子和靶基因质粒的稳定细胞株，我们推荐将它们依次转人细胞。

a.稳定地整合转录因子载体质粒到宿主细胞中。

b.通过瞬时转染感兴趣的靶基因或易检测的靶基因筛选单克隆（如pZI2I_hGH-2)。

c.选择背景最低且对雷帕霉素或AP21967诱导的依赖性最高的克隆。

d.稳定地整合IG基因质粒到宿主细胞中。

e.筛选背景最低且二聚体药物依赖性靶基因表达水平最高的单一的克隆。
转录因子和靶基因质粒必须同含有不同的选择标记的载体共转染或者亚克隆到含有选择标记的载体中（见上面的步骤3)。

病毒载体感染

将适宜的病毒载体转导到细胞内，如反转录病毒载体（Pollocketd.2000)。转录因子反转录版本和粑基因载体信息均可从ARIAD(www.ariad.com/regulationkits)获得。

靶细胞内二聚体介导的基因表达

5.准备二聚体。给出的例子是AP21967。雷帕霉素（914Da)或者AP23102(1019.3Da)能以相似的方法准备或储存。

a•准备冻干的AP21967(分子质量1017.4Da)在体外使用，加人冰冻的无水乙醇到干粉中配成lmm〇l/L的溶液（如溶解250ugAP21967用246ul无水乙醇)。

密封并间歇地旋涡振荡几分钟使化合物溶解。溶解时于冰上操作使其蒸发最少。

b.将二聚体储存液避光保存于一20°C于玻璃瓶或小离心管。以相同的方法保存其他乙醇稀释液。以这种方法储存的试剂至少在一年内是稳定的。

在工作台上，将乙醇溶液置于冰上，每次打开的时间尽可能短，防止药物挥发和由此所致的浓度变化。

在大多数应用中，AP21967是我们推荐的二聚体，因为它同當帕霉素相比抗增殖活性是减弱的。

c•准备含期望浓度二聚体的培养基通过直接从乙醇储存液中取二聚体药物加人或在使用前以培养基多次稀释。

在后一种情况下，为保证在（水）培养基中完全溶解，最高浓度不能超过5umol/L。在另一种情况下，加到哺乳动物细胞的培养基中的乙醇终浓度必须保持在0.5%以下(200倍稀释100%的乙醇溶液）以防止溶剂对细胞的有害作用。

6•以含二聚体的培养液替换靶细胞的培养基。

单次给以二聚体药物通常足够诱导3d的表达。为了长期的实验，每次细胞换液时（如每3天一次）换用含二聚体的新鲜培养液。

7.确定表达的剂量反应和动力学。在起始的实验中，检测宽范围的浓度（如0.01〜1000nmol/L)的AP21967得到完全的剂量反应图谱（见疑难解答)。