实验材料 | 母板 试剂、试剂盒 | 细菌细胞中的标记LB培养基氨苄青霉素乙醇Super肉汤培养基甘油96孔碱裂液TlowE缓冲液10XPCR缓冲液20XSSC琥拍酸酐 仪器、耗材 | 96深孔板和V形塑料细胞培养皿水平微量培养板离心96孔多位点复制针1加仑储存袋多微孔的带层带孔的振荡器用于深孔板消毒密封的96孔板薄96孔PCR孔板和密封的PCR板96孔加热循环控制装置微滴定率冲洗板培养箱智能玻片打印机 实验步骤 | 1.密封的低密度标准培养基中37°C培养过夜(大部分卖方提供低密度培养基)。如果已经高密度培养过可以省去这个步骤,否则会降低活性。 2.准备重复的96孔板分别标记,每孔中加入100ul的含100ul/ml氨苄的培养基。(通过氨苄抗性检查EST克隆)标记孔板以方便辨认。
4.将96孔多位点复制针浸入纯乙醇溶液中,火烧。冷却后挑克隆于装有LB的孔板中,可重复操作确保接种。 5.将孔板置于含湿润带层的1加仑储存袋中37°C培养过夜。 6.在96孔板中加人Iml含lOOul/ml氨节的SuperBroth中。用多位点复制针接种到新鲜的LB中,盖上盖后在深孔板振荡器上200r/min37°C摇24h。 7.每孔中加50ul45%灭菌甘油,-80°C保存。 8.预温裂解液(来自裂解试剂盒)于37°C直到SDS溶解。加入1mlRNase于IOOml重悬液中,4°C保存。 9.每孔中加350^1100%变性乙醇(来自试剂盒)。盖上滤纸,小心操作以防孔板装得太满。 10.1500g离心7min。迅速倒置弃上清后换上一张干净的滤纸。要迅速,否则沉淀将浮起或移动。 11.每孔加入100ul含RNase的重悬液重悬。全部重悬后加入100ul裂解液,轻轻混匀避免振荡染色体DNA。 12.每孔加入100ul沉淀液,充分混匀后加100ul中和液。混勻后转移到试剂盒提供的孔板里。 13.1500名离心12min。弃上清后加乙醇洗后滤出。用滤纸吸干多余的乙醇。 14.每孔中加入500ul70%乙醇。迅速倒掉,吸掉多余的乙醇。将孔板放置于一干净容器中,盖上干净滤纸过夜。 15.重悬DNA用200ulTlow溶液。密封让其在4°C溶解至少2d才能用。质粒保存温度为-20°C。 16.扩增96孔板中的DNA,以下是PCR反应试剂: 17.标记薄%孔PCR板,标记供体和受体板在板的Al孔处以确定方向。 18.每孔中加100ulPCR反应混合试剂。轻轻加人确定孔底没有气泡后,每孔中加入Ijul纯化的EST质粒模板。确定模板都加人到了PCR反应试剂中。 19.以下是循环体系: 20.用2%的琼脂糖胶电泳2ul的PCR产物,选用适当大小的分子标记(支持方案1)。如果扩增产物已经被证实了,每个孔板只要分析一排就够了。 21.选取孔板中一排中的一个孔,用荧光测定法分析1ul扩增产物(支持方案2)。 22.每孔加200ul乙醇/乙酸盐溶液于96孔V形底板。再每孔中加100ulPCR产物进行纯化,用移液枪混勻4次。 23.于-80°C培养lh过夜,充分溶化。 24.4°C下2600g离心40min。弃上清,留10~20u1在底部避免吸到沉淀。 25.用20ul70%乙醇洗沉淀,4℃下2600g离心40min。吸去上清让其在一封闭容器中风干过夜。不要用快速蒸发器。 26.每孔中加40ul3XSSC,小心密封孔板。将孔板置于加热储存袋中。将加热储存袋放置在65°C培养箱中2h,之后让其自然冷却。 27.选取孔板中一排中的一个孔分析1ul提纯的重悬PCR产物用2%的琼脂糖胶跑胶(支持方案1)。查看跑胶条带。产物于一20°C保存。 28.在转移PCR产物到玻片前,详细参看打印笔的说明。 29.用多聚L-赖氨酸包被玻片(支持方案3)。 30.将溶解的纯化PCR产物167g离心2min。转移5~10ulPCR产物于孔板中,这将作为打印的原液。
31.带有DNA溶液和连续沉积溶液的笔在玻片上打点。用重复的打印检查玻片上点的大小和位置。同样证实了笔能携带溶液并打点,这样简单的负荷物能产生出我们所需要的玻片。 32.如果一个或者更多的笔没有在要求的水平,重新清洗或者换另一个笔重新检测。如果所有的笔都显示了,进行全部的印记。 33.印记最后,从印记仪上取下片子,在片子边缘用玻璃刀标明编号和印记标记。并用玻璃刀刻线来标明这片子在第一块片子上的印记区域。将片子放到清洁的玻片盒,可存放一周。 34.将片子印记的一面向上放置,在一个约24cmX34cmX5cmPyrexbaking皿中,盖上塑料盖。将片子用450mJ强度的紫外线照射。将片子转移到不锈钢架子上,并将架子置于小的玻璃容器中。 35.溶解6.Og琥珀酸酐于325ml1-甲基-2-吡咯酮在玻璃容器中,用玻璃棒搅拌加速溶解。 36.加25mllmol/L硼酸钠缓冲液到烧杯中。搅拌混合几秒钟,然后迅速倾倒到放片子^玻璃容器中。将玻璃容器放到摇床,70~90r/min摇20min。 37.浸片子到沸水中。立即关掉加热器,让片子在热水中孵育2mm。将片子转移到1L盛有无水乙醇的玻璃容器中孵育4min。 38.转移片子到水平离心机中,167g离心3min。转移片子到一个清洁的片子盒,竖直放置过夜,准备杂交。 |
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