【求助】Elispot检测单核细胞活化后TNF-α释放
2006-01-13
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MandM
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大家快帮帮我。。。真的好着急。。。:(
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brisk2004
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做ELISPOT实验时,培养基是很重要的一个环节,如果你的培养基中含有热原的话,那么你的ELISPOT中阴性很可能就有一些点出现,还有我不知道你为什么要用磁珠来分离单核细胞?那样有必要吗?在磁珠分离的过程中也有可能受到其他的刺激。还有我不知道你的ELISPOT的基本过程是什么?我把我们的过程大致和你说一下:14度包被抗体过夜2PBS洗板一次,封闭1h,3洗板4次,加入刺激剂,种入细胞,刺激24h小时4PBS3次,PBST3次,加入生物素标记的一抗5PBST6次,加入HRP/AP标记的亲和素6PBST3次,PBS3次,显色
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MandM
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谢谢brisk2004先。我的培养基是低热原的,包括血清,也是低热原的进口血清。我第一次做是贴壁分离单核细胞的,结果也是阴性孔有很多点,当时怀疑是不是把单核细胞从平皿上挂下来的时候刺激了它,所以第二次做就用的磁珠阴性分选,这个试剂盒是用磁珠标记除单核以外的单个核细胞的,所以单核细胞理论上应该是不受刺激的。我的具体过程和您的一样。1。70%乙醇活化PVDF膜,无菌水洗。2。4度包被单抗包被过夜3。PBS洗板5次,37度封闭1h。4。PBS洗一次或者不洗。加入50微升刺激剂,接着加入100微升细胞,培养24h。5。倒掉细胞,加入冰冷去离子水,处理10分钟。6。PBST洗10次,加入生物素标记检测抗体,37度1h7。PBST洗5次,加入HRP标记亲和素。37度1h8。PBST洗5次,解冻显色液,每孔100微升,显色5-10分钟。
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