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【求助】有人用过凯基膜蛋白提取试剂盒么~跑wb着急啊~
2021-08-01
问题描述:

买了南京凯基的膜蛋白和浆蛋白提取试剂盒,浆蛋白有条带,可是膜蛋白跑了很久没跑出过条带。。。
之前是担心所需组织量不够(要求是200-300mg,我的组织只有20mg左右)才跑不出来,后来换用大鼠心脏测试,组织量绝对够。。。而且在跑western之前进行了说明书上的蛋白浓缩步骤,可是在加loADIngbuffer之后,蛋白沉淀怎么都溶解不掉~说明书也注明了如果有沉淀可以取上清继续上样,可是每次上样感觉样品往上浮,只有部分样品往孔里沉,而且跑出来什么都没有,连内参都没有。用的是β-actin的内参。。
western之前浓缩步骤如下:
1、取所得提取物,每100ul膜蛋白加入约300ul的溶解buffer和约100ul三氯乙酸(TCA)试剂,混匀后置冰上20-30min后,13000rpm,离心15min,尽可能去除上清。
2、沉淀加入1ml丙酮,室温静置10min后,13000rpm离心15min。
3、弃上清,沉淀真空旋干或置冰上干燥10min(敞开离心管盖),按适当体积比加入loadingbuffer(使用前没100ulloadingbuffer加入2-5ulβ-巯基乙醇)溶解,彻底分散(枪头反复吹吸或剧烈涡旋),煮沸5min。【注:加入loadingbuffer后如有部分难容物,可取上清继续上样。】

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cooloe
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自己顶~~~
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Jimmy0909
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试剂盒没用过,猜测溶解buffer里应该含某种去垢剂抽提膜蛋白,这一步要充分混溶,再用TCA沉淀。我怀疑你直接加在了一起,膜蛋白没有被充分抽提,随着疏水相被弃了(上清)。
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Jimmy0909
  用户
另外,TCA一步加0.02%脱氧胆酸钠,丙酮沉淀这步省略掉吧,我怀疑这对膜蛋白复性不好。不过我没实验,你可以试试加和不加丙酮对你膜蛋白抽提的影响。
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