凝胶浓度与蛋白质分离范围

不同浓度分离胶的制备（两块胶）

*1.5mol/LTris-HCL，pH8.8。

**29.2g丙烯酰胺，0.8g甲撑双丙烯酰胺/100ml水。

4﹪浓缩胶的制备（两块胶）

*0.5mol/LTris-HCL，pH6.8。

一试剂配制：

110%APS

1g溶于10ml水，小管装，外包铝箔

2TrisHCl（ph8.8）1.5M

18.171gTris-base溶解到60ml水，调节PH为8.8，定容到100ml

3TrisHCl（ph6.8）0.5M

6.057gTris-base溶解到60ml水，调节PH为6.8，定容到100ml

410×TBSPH7.6

NaCl80g

Tris-base24.2g

HCl调PH到7.6，超纯水定到1L

5TBST（现用现配）存放于4度冰箱

10×TBS50ml；450ml水；500微升Tween-20

62×LoADIngBuffer100ml

0.5MTrisHCl（ph6.8）20ml;甘油20ml;10%(W/V)SDS40ml;2-β-巯基乙醇10ml;0.1%(W/V)溴酚蓝5ml;ddH₂O5ml。

710×TransferBuffer1L

144gGlycine

30.3gTris-base

定容到1L,用时稀释到1×

810×SDSBuffer1L

144gGlycine

30.3gTris-base

10gSDS

定容到1L,用时稀释到1×

9封闭液

5%（W/V）脱脂奶粉，用TBS稀释

10一抗稀释液

2%（W/V）BSA，用TBST(0.1%（V/V）Tween-20)稀释

11二抗稀释液

2%（W/V）脱脂奶粉，用TBST(0.1%（V/V）Tween-20)稀释

二提取蛋白：

1把培养皿置于冰上，倒掉培养液，并用PBS洗涤细胞，然后弃去洗液。

2将1ml细胞裂解液（配方如下所示）加入培养皿，晃匀置于冰上30min，每5min晃一次。

3裂解完后，用干净的刮子将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

4将收集下来的细胞于4度下12500rpm离心15min。

5将离心后的上清加入等体积的2×loadingbuffer，煮沸5min。

1ml细胞裂解液：

0.5ml水

0.5ml裂解液

10µl蛋白酶抑制剂

10µlNa2VO3（100mM）

1µl胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）

其中：

一，2×裂解液（calbiochem）100ml

NaCL：1.578g

β-gly：1.08g

Tris：0.485g

EDTA：0.1489g

sp（焦磷酸钠）：0.1784g

DTT(二硫代苏糖醇)：0.0617g

Triton-100：2ml

甘油：20ml

HCL调pH至7.5，定容至100ml

二，蛋白酶抑制剂

亮肽酶素（leupeptin）：1mg/ml（用水溶解，终浓度1µg/ml）

抑酞酶（aprotinin）：1mg/ml（用水溶解，终浓度1µg/ml）

即，将1mgleupeptin与1mgaprotinin溶解在1ml水中，稀释10倍后分装（20µl一管）并储存于-20度，每用一次拿出一管。

三，胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）：

1mg/ml（用乙醇溶解，终浓度1µg/ml），储存于-20度。

四，Na2VO3储存于4度。

三煮样

将等体积的2×LoadingBuffer加入到细胞裂解液中（即，2×LoadingBuffer：样品=1：1），在沸水浴中煮沸5min，防止爆盖。煮沸后在离心机上瞬时甩一下，保证样品充分混匀。

四电泳

浓缩胶4%，分离胶12%（小分子为：15%）；

电泳：85V跑至Marker出现分离，135V溴酚兰刚跑出胶板。；

五转膜

转膜：恒流0.35A，100min，0.45微米孔径的NC膜，（小分子为：恒流0.3A，60min，0.22微米孔径的NC膜）；要在冰浴中进行（转移前将胶和膜在转移缓冲液中浸泡20min）。

注意：转膜时两份滤纸不能接触，否则会短路，电流不会过胶和膜！

六封闭

5%脱脂奶粉（TBS配置）；室温1小时；

TBST洗膜3次，每次5min。

七孵育一抗

1：500（2%BSA的TBST配制），4度过夜；

TBST洗膜3次，每次5min。

八孵育二抗

羊抗兔，荧光二抗（1：5000，2%奶粉TBST配制）；室温1-2小时避光；

TBST洗膜3次，每次5min,最后超纯水洗膜1次，5min。