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保持清洁及宽敞,必要物品,例:试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。(网络信息仅供参考,细胞无菌操作很重要,细胞污染预防等问题可咨询通派细胞库管理员,获取准确的细胞信息)实验用品擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。
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JCB核孔转运时间和效率取决于输入素的浓度:
组成NPC的特征蛋白为糖蛋白gp210和核孔素(nucleoporin,Nup);糖蛋白gp210为一种跨核膜的N-连接糖蛋白,(通派细胞库供应:Ecv304细胞株)能与伴刀豆球蛋白A强烈结合,作用是将NPC固定于核膜上;
核孔素为一组由8~12种O-连接糖蛋白构成的蛋白家族,(通派细胞库供应:T-24细胞株)与麦胚凝集素(WAG)亲和,广泛分布于NPC孔周围,在细胞质与细胞核内也可检出,作用与生物分子的核质转运有关。
在分子结构上gp210有锚定NPC核膜的结合域及与亲核素蛋白结合的结合域,(通派细胞库供应:Pc-3m细胞株)而核孔素蛋白分子上至少有三类重复序列,其中N末段有FG二肽结构域[3,4],这些序列都是生物大分子进行核质转运的分子基础。
生物大分子的细胞核质转运过程;在入核转运过程中存在于胞质中的具有核定位信号肽(nuclearlocationsignal,NLS)的转运蛋白(简称NLS蛋白);(通派细胞库供应:CEF细胞株)首先与NPC附近Importinα结合,Importinα再与Importinβ相结合形成NLS-Importinα/β复合体。
然后NPC内核孔素蛋白通过其自身重复序列与Importinβ结合,(通派细胞库供应:HEB细胞株)并将NLS-Importinα/β复合体定位(docking)在NPC胞质纤丝上,随后胞质纤丝发生弯曲将其复合体依次递呈到细胞NPC中央插销蛋白上,并与核质纤丝发生结合、解离平衡,复合体被送入细胞核内。
复合体在通过NPC中央孔时所耗能量由RanGTPase水解GTP提供,(通派细胞库供应:DT40细胞株)同时激活Importinβ,后者可使Importinα和NLS分别从NLS-Importinα/β复合体上释放下来,NLS分子在核内马达分子(motor)推动下沿核内骨架发生固相传输(solidtransfer)。
核内Importinβ与RanGTP结合成二聚体再转运回胞质,(通派细胞库供应:A549细胞株)胞质中Importinβ/RanGTP二聚体在RanGTPase作用下解离为Importinβ和RanGDP,Importinβ继续参与下一轮NLS蛋白的入核转运;
核内Importinα的出核转运过程较为复杂,(通派细胞库供应:Raw264.7细胞株)首先核内Importinα在CAS蛋白和RanGTP作用下形成三联体转运回胞质,然后三联体在胞质RanGTPase作用下解离为Importinα、CAS和RanGDP。
后胞质Importinα继续参与下一轮NLS蛋白的入核转运过程,CAS则直接返回细胞核内。
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