新药研发中激酶类靶点酶学检测方法的建立和优化

成都先导药物黄药师

一个早期药物发现的项目往往是从高通量筛选（HTS）拉开序幕，我们得到这么一批种子，它们称为hits。当然这些hits在invitroassay中对靶蛋白有抑制作用，但它们并不完美，可能还需要一轮一轮的打磨，从而筛选得到具有更高抑制效率，更高生物利用度，更安全的先导化合物，这个过程称为SAR（structureactivityrelationship）。先导化合物的优化往往从potency开始，同时还要优化solubility，safety，absorption，metabolicstABIlity。这本书从potency的优化着手，讲解了invitroassay的建立；另外小分子化合物可能以不同的方式结合靶蛋白，意味着每种小分子可能有着不同的结合动力学参数，为了达到最佳的体内药效，检测与分析小分子的作用模式也十分重要。

1.激酶酶学检测方法的建立

激酶的酶学assay并不难，但为了得到清楚可靠的数据在建立assay时需要进行一系列的优化。其中需要优化的要素包括：ATP，底物，激酶的浓度，反应buffer的成分，反应时间。本文用AGC激酶家族的ROCK2作为一个例子，分析激酶的酶学assay优化步骤。

第一步，确定assay底物是否合适，确定激酶浓度与assay信号间的线性。

Assay优化的目的是为了使assay既能够给出尽量高的信号又确保激酶活性与信号间的线性，因此找到一个能够被激酶高效磷酸化的底物是assay建立的第一步。同时，需要确定一个合适的激酶浓度进行assay优化。当激酶的浓度较低，在一定反应时间内得到的信号值较低，信噪比也较低。在过高激酶浓度的反应体系之中，随着反应进行大量底物都被充分转化，导致激酶活性失去与信号值间的线性关系（Figure1.1）。所以我们应该选择信号值较高并与激酶活性呈线性关系这样的激酶浓度条件。

Figure1.1激酶活性与assay信号之间的线性关系

对ROCK2酶学assay的优化中，首先检测了ROCK2的7种底物在不同ROCK2浓度下的磷酸化效率。实验中发现S6-derivedpeptide作为底物能够得到最高信号，线性区域在0.5-7nMROCK2浓度。因此可以选定S6-derivedpeptide作为底物，0.5nMROCK2作为优化的激酶浓度。

Figure1.2ROCK2不同底物随激酶浓度变化的磷酸化信号

第二步，优化反应buffer降低assaywall

反应buffer优化的目的是为了使反应体系达到在尽量低的激酶浓度下产生尽量高的信号。之所以要使用尽量低的激酶浓度，一方面是降低成本的考虑，另一方面激酶浓度本身也限制的IC50的检测下限。一个激酶的酶学assay所能检测的IC50值不可能低于反应体系中激酶浓度的一半（Figure1.3）。比如assay中ROCK2的浓度是1nM，那么我们只能检测到IC50最低为0.5nM的抑制剂。即使真实IC50值为0.1nM，而我们通过assay检测到的IC50值（IC50obs）依然是0.5nM。这一现象被称为“assaywall”。因为如果反应体系中小分子化合物的摩尔量已经小于激酶量的一半了，那么每两个激酶已经分不到一个化合物，不能够使半数的激酶活性得到抑制。因此随着SAR的推进，IC50逐渐变小，我们应该注意IC50是否已经接近assaywall。

Figure1.3随着激酶浓度升高不同化合物IC50obs不同程度偏离真实IC50

当然我们也可以通过优化反应buffer，进一步降低体系中激酶的浓度，从而降低assaywall。由于大多激酶依赖Mg2+或Mn2+离子作为中间反应的磷酸根受体，所以buffer的优化应该包括：Mg2+，Mn2+，Na+，Ca2+等离子浓度，去垢剂的浓度，pH值。图1.4表明不同的Mg2+与Mn2+浓度组合对assay的影响。在10mMMg2+，没有Mn2+的条件下，assay具有最好的信号。另外NaCl，CaCl2，正钒酸钠降低assay信号，而Tween20，TritonX-100或NP-40对assay信号没有显著影响。用不同的buffer系统覆盖pH5.5-8.5区域，发现最佳的pH值为7.5。

Figure1.4ROCK2反应buffer离子、去垢剂浓度、pH的优化

不同激酶的MgCl2/MnCl2偏好差异较大。ROCK2喜欢10nMMgCl2和无MnCl2的buffer；PknG激酶喜欢有Mn2+无Mg2+的环境；而PDGFRβ则Mg2+、Mn2+通吃（Figure1.5）。此外，不同激酶对CaCl2，去垢剂和磷酸酶抑制剂的耐受都有差异。

Figure1.5不同激酶对MgCl2/MnCl2的偏好差异

第三步，米氏常数与ATP浓度的选择

由于大多数的激酶抑制剂是ATP竞争抑制剂，因此ATP的浓度决定了该assay是否能够有效评价小分子抑制剂的作用。如果在所有激酶assay中使用相同的ATP浓度可能会使抑制剂选择性筛选更加方便，但是将导致我们不能够准确比较一个抑制剂对不同激酶的抑制作用。因为根据Cheng-Prusoff方程，IC50与ATP浓度呈线性关系。其斜率就是由抑制常数Ki和米氏常数Km决定的。Ki反映抑制剂与激酶的亲和力，Km反映ATP与激酶的亲和力。由于一个抑制剂与不同的激酶结合有不同的亲和力，不同的激酶与ATP的亲和力也不一样。因此利用Cheng-Prusoff方程可知，不同激酶斜率不同的情况下，统一的ATP浓度中IC50并不能客观反映抑制剂与激酶的亲和力。图1.6中，10μMATP与20μMATP下，抑制剂对不同激酶的IC50并不一致，无法进行比较。所以在assay中我们一般也不会采用胞内ATP的生理浓度。除去以上原因之外，还因为我们对不同细胞种类，细胞亚结构，不同病理情况下的ATP浓度缺乏研究。

而根据图1.7的Cheng-Prusoff方程，当ATP浓度等于Km值时，IC50等于两倍Ki，因此能够直接反应抑制剂与激酶间的亲和力。Km的定义是一半最高反应速率时的ATP浓度，这样对于不同的激酶反应ATP浓度是不一致的。所以对于ROCK2酶学assay的ATP浓度，先计算Km为25μM，因此应该选择25μMATP浓度。

Figure1.6IC50随ATP浓度而变化，对于不同激酶其斜率并不一致

Figure1.7当ATP浓度等于Km值时，IC50等于两倍Ki

第四步，反应时间与激酶浓度与信号线性的考察。

在优化好buffer成分和ATP浓度后，下一步就需要进一步优化激酶浓度与反应时间，保证信号在线性范围内测得的IC50（IC50obs）反映真实的IC50。越长的反应时间，越高的激酶浓度，将导致更多的底物被转化，随着底物转化的比例增高，IC50obs/IC50的值逐渐增大（Figure1.8）。如图1.9，我们可以选择不同的ROCK2激酶浓度和反应时间组合。如果需要更短的反应时间，可以选择10nMROCK2浓度和60min反应时间；如果需要更低的ROCK2浓度得到更低的assaywall，则可以选择2.5nMROCK2浓度和240min反应时间。

Figure1.8IC50obs/IC50随着底物转换比例升高而增大

Figure1.9不同ROCK2浓度和不同反应时间的优化

第五步，检测referenceinhibitorIC50确认assay结果的可靠性

最后就是需要采用优化好的反应条件验证referenceinhibitor的IC50。一方面，测得的IC50需要与相关报道在3倍误差内，另一方面，反映IC50曲线斜率的Hillcoefficient要在0.5-1.8之间。如果Hillcoefficient偏离1较多，可能是反应体系中有其他激酶的污染，或者是该激酶的其他剪切突变体、二聚体、不同的磷酸化状态的存在。

进行完这一系列的优化，这个assay就可以用于药物筛选和SAR了。后面将继续介绍药物分子与激酶结合模式的检测，激酶靶标相关的ADME检测。