己糖激酶的测定实验一基本方案
| 实验方法原理 | 直接测量己糖激酶的反应： D-葡萄糖＋ATP→6-磷酸葡萄糖＋ADP 简单的光度测量是达不到的，葡萄糖的磷酸化最好用测量磷酸或者ATP32标记的办法。由于通过层析，G6P的实验必须完全与ATP和ADP分开，因此，建议应用HPLC方法。酶的实验通常是酶与G6P脱氢酶反应偶联:
D-6-葡萄糖＋ATP＋NADP＋→6-磷酸葡萄糖＋ADP＋NADPH＋H＋ 这些反应都已经通过光度测量实现。当使用这个偶联的系统，首先应该单独进行G6P反应实验，然后在己糖激酶的存在下用葡萄糖和ATP取代G6P继续反应。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 己糖激酶 试剂、试剂盒 | 三乙醇胺-HClNaOHD-葡萄糖ATPMgCl2NADP6-磷酸葡萄糖脱氢酶 仪器、耗材 | 分光光度计 实验步骤 | 实验所需「试剂」具体见「其他」 0.98ml实验混合物
0.02ml酶样品 25℃时，于340nm处吸收值升高，ε340＝6.3×103l/（mol·cm）。 注意事项 | 其他 | 试剂： 100mmol/L三乙醇胺-HCl/NaOH，pH7.6（三乙醇胺-HCl，用1mol/LNaOH调节） 1.0mol/LD-葡萄糖（Mr＝180.2；18g/100ml） 0.1mol/LATP（二钠盐，三水合物，Mr＝605.2；605mg溶于10ml水） 0.1mol/LMgCl2（六水合物，Mr＝203.3；203mg溶于10ml水中） 0.01mol/LNADP（二钠盐，Mr＝787.4；79mg溶于10ml水中） 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（商业品有100～500U/mg，准备时稀释至大约5U/0.1ml） |
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发布于 ： 2018-08-06
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