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快速脂质体转染

来自 : mayitao

快速脂质体转染

脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。实验者曾运用脂质体来模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，在细胞转染实验中经常用作外源物质进入细胞的载体。

实验原理

脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（结果可参照表1所示）。
细胞种类：COS-7、BHK21、293E、SW480等均可作为受体细胞。脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调，因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。虽然人们早已发现脂质体对细胞有一定的影响，但由于一直没有更高效的转染方法来代替脂质体，所以脂质体转染试剂的选择非常重要。本人所用的转染剂为本人使用的是北京义翘神州的高效转染试剂Sinofection0.75ml，所用细胞为293Ecell。

实验步骤

1.转染前准备：将浓度1.5-4.5×10⁴cells/L的293E细胞接种于板在5%CO2，37℃条件下培养18-24h。
2.转染液的制备：
（1）用无血清 培养基于EP管中稀释0.2µgDNA至25μL，室温5分钟；
（2）往DNA稀释液中加入sinofection至50μL，混合均匀，室温放置15~20min。
3.将转染液加入DMEM+10%FBS，5%CO2，37℃孵化培养4-6小时；
4.基因表达是在48-72h后测试。
表1不同细胞系sinofection用法（96孔板）

Celltype	Culturemedium	Cellsperwell	DNA	Sinofection	Mediumchangeafter4-6h
293H	DMEM	3×10⁴	0.2µg	0.5µL	DMEM+10%FBS
293FT	DMEM	3×10⁴	0.2µg	0.5µL	DMEM+10%FBS
293E	DMEM	3×10⁴	0.2µg	0.5µL	DMEM+10%FBS
293F	DMEM	3×10⁴	0.2µg	0.5µL	DMEM+10%FBS
COS7	DMEM	1.5×10⁴	0.4µg	0.5µL	DMEM+10%FBS
hela	DMEM	2×10⁴	0.3µg	0.5µL	1640+15%FBS
Caco2	MEM	3.5×10⁴	0.3µg	0.75µL	MEM+10%FBS
BHK21	MEM	2×10⁴	0.2µg	0.5µL	MEM+10%FBS
CHO-DG44	DMEM+HT+pro	2×10⁴	0.5µg	0.5µL	DMEM+HT+pro+10%FBS
RAW264.7	DMEM	3×10⁴	0.2µg	0.5µL	DMEM+10%FBS
MCF7	MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin+sodiumpyruvat	2×10⁴	0.1µg	0.25µL	MEM/NEAA+0.01mg/mLinsulin+sodiumpyruvat+10%FBS
SW480	IMDM	3×10⁴	0.4µg	0.5µL	IMDM+10%FBS
MDCK	DMEM	4×10⁴	0.6µg	1µL	DMEM+10%FBS
CHO-K1	IMDM+Pro	3×10⁴	0.2µg	0.5µL	IMDM+Pro+10%FBS
HepG2	DMEM	3×10⁴	0.5µg	0.75µL	DMEM+10%FBS
A549	DMEM	2×10⁴	0.3µg	0.5µL	DMEM+10%FBS
NIH/3T3	DMEM	1.5×10⁴	0.1µg	0.75µL	DMEM+10%FBS
vero	DMEM	3×10⁴	0.3µg	0.75µL	DMEM+10%FBS
sf9	SIMSF	5×10⁴	0.4µg	0.75µL	SIMSF+10%FBS