细胞凋亡检测实验一DNA 片断化检测
| 实验方法原理 | 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNAladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成。 |
|---|---|
| 实验步骤 | 一、大分子染色体DNA片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。 二、DNALadder测定 收获细胞（1X107）沉淀?细胞裂解液13000rpm′5min,收集上清1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h。蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过夜。14000rpm′15min最后将沉淀溶解在TEbuffer中，加DNALoADIngBuffer1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。 三、凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析 收集细胞，70%冷乙醇（inPBS）4°C固定过夜，PBS洗涤，1000rpm′10minRNaseA（0.5mg/ml）37°C消化30minPI（50mg/ml）染色，室温避光15min，FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。 四、ApoAlertTMLM-PCRLadderAssay(CLONTECH) 敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。 |
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发布于 ： 2018-08-03
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