石蜡包埋组织样本的制备
实验材料 | 组织胰蛋白酶 试剂、试剂盒 | 二甲苯乙醇生理盐水 仪器、耗材 | 尼龙网 实验步骤 | 1.把石蜡包埋组织切成40~50μm厚的组织片3~5片,或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒状,放入10ml的试管中。 2.加入二甲苯5~8ml时,在室温下脱蜡1~2d,视石蜡脱净与否,更换1~2次二甲苯,石蜡脱净后,弃去二甲苯。 3.水化:依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml,每步为10min,去乙醇,加入蒸馏水3~5ml,10min后弃之。 4.消化:加入2ml0.5%胰蛋白酶(pH1.5~2.0)消化液,置37℃恒温水浴中消化30min,在消化期间,每隔10min用振荡器振荡1次。 5.消化30min后,立即加生理盐水终止消化。 6.经300目尼龙网过滤,未消化好的组织可做第2次消化。 7.收集细胞悬液,离心沉淀1500r/min,再以生理盐水漂洗1~2次,离心沉淀500~800r/min,去碎片。 8.保存细胞备用。 注意事项 | 1.一定要将石蜡从组织中脱干净,一般脱蜡第1遍应在12h左右,第2遍为30min左右。检测是否将石蜡已脱净的方法是弃去二甲苯,加入无水乙醇,如果无絮状物浮起,即可视为蜡己脱净;反之,则蜡尚未脱净。 2.消化时间不可过长,以免造成已释放出的细胞核被消化。 3.切片不可过薄或过厚,过薄细胞碎片过多,影响分析结果;过厚造成脱蜡不理想。 4.消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎,然后再加胃蛋白酶消化,30min,37℃,然后用尖吸管吹打成悬液状。 5.消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少,这样就要将组织片放在300目尼龙网上,用底部圆滑的试管磨碎,再用PBS液冲洗一下;如此反复,就能得到较多的单细胞悬液。 |
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发布于 : 2018-08-10
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