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jackson二抗实验方法知识宣传
来自 : 蚂蚁淘
  1. 什么是抗体?
    抗体(antibody, Ab)B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白,主要存在于脊椎动物的血液和B淋巴细胞膜表面,通过与相应抗原特异性结合,发挥体液免疫的功能。

    1. 结构呈“Y”字型

    2. 球状蛋白质

    3. 普通的抗体:4条多肽链-两条重链(H链(γ、α、μ、δ和ε五种))两条轻链(L链κ和λ两种);

    4. 普通的抗体:8个结构域

    5. 可变区和恒定区

    6. 二硫键和共价键链接

    7. 根据重链不同:IgG、IgM、IgE、IgA、IgD 五个类别

 

 

Y型结构  球状蛋白

两条轻链(H链)+两条轻链(L链)8个结构域

 

 

可变区 恒定区

Fab  (Fab)2  :可变区

Fc段:恒定区

*知识小分享:非普通免疫球蛋白指的是驼类抗体和软骨鱼类抗体,这两类抗体均没有轻链,各由2条重链组成,因此又被称作“重链抗体”(heavy-chain antibody);鲨鱼的抗体多了三对重链结构域。

 

 

一抗:就是平时所说的抗体。能和非抗体性抗原(特异性抗原)特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。

 

二抗:能和抗体结合,即抗体的抗体,其主要作用是检测抗体的存在,放大一抗的信号。

 

如何正确选择二抗?

  1. 二抗的来源-种属来源

    二抗的Fc段属于恒定区,每个种属的Fc段都相同。因此二抗的选择首先取决于一抗的物种来源,一抗来源于哪种物种,二抗就选择抗此物种;比如,一抗是小鼠源,二抗就选择抗小鼠;一抗是兔源,二抗就选择抗兔。

  2. 三种形式的选择

    1)Whole IgG 

    2) F(ab)2 fragment

    3) F(ab) fragment

  3. 二抗的特异性:不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构,抗体的生产过程也相似。抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应,这种情况会事先做特殊处理,抗体会有标记min X Bov, Hu, Ms, Rb, Rat SrProt……

 

 

 

Anti-lgG(H+L)

整个抗体分子,可与抗体的任何部位结合

Anti-IgG,Fc fragment specific

与 IgG重链的Fc部分结合;这类抗体需要额外检测和处理来降低和IgM和IgA的交叉反应,如“Anti-IgG,Fc Y fragment specific”

Anti-lgG,F(ab)2 frangmentspecific

与 IgG的F(ab)2/Fab部分结合

Anti-lgG,Fcy subclass specific

与不同的小鼠亚型

 

  1. 二抗的耦联标记

    常用的标记物:酶、荧光素和生物素。

实验类型

标记物选择

Western blot /ELISA

免疫组化

辣根过氧化酶(HRP)/碱性磷酸酶(AP)

细胞(流式FC)或组织实验

荧光基团

得到更大的检测信号

生物素(biotin)/抗生素蛋白

 

 

 

 

 

蚂蚁淘品牌推荐:Jackson二抗

1、种属丰富

种属丰富

Alpaca(羊驼)

Bovine(牛)

Cat(猫)

Chicken(鸡)

Dog(狗)

Goat(山羊)

Guinea Pig(天竺鼠)

Syrian Hamster(叙利亚仓鼠)

Horse(马)

Human(人)

Mouse(小鼠)

 

Armenian Hamster(亚美尼亚仓鼠)

2、标记物多

实验

Unconjugated

不带标记

Horseradish Peroxidase

辣根过氧化酶

WB ,ELISA,IHC ,ICC

Alkaline Phosphatase

碱性磷酸酶

Biotin-SP

生物素

DyLight™405A=400, E=421

荧光

FC(流式),IF

CoumarinAMCAA=350, E=450

Alexa Fluor®488A=493, E=519

Fluorescein(FITC)A=492, E=520

CyanineCy™3A=550, E=570

Rhodamine(TRITC)A=550, E=570

RhodamineRed™-X (RRX)A=570, E=590

Alexa Fluor®594A=591, E=614

Alexa Fluor®647A=651, E=667

 

3、Jackson二抗的主要形式

1)Whole IgG

2) F(ab)2 fragment

3) F(ab) fragment

 

 

抗体形式

特点及应用

Whole IgG Affinity-Purified Antibodies

完整的分子,适用于大部分实验,性价比最高

F(ab') Fragment Affinity-Purified Antibodies

降低二抗中Fc端的非特异性结合,避免抗体与Protain A或者G结合

Fab Fragment AffinityPurified Antibodies

只有一个结合位点,用来封闭内源性的免疫球蛋白;相同物种来源的一抗中做多标记

Anti-Mouse IgG Subclass Specific Antibodies

 

区分不同的小鼠IgG亚型

FabuLight™ - Affinity-Purified Fc Specific Fab Fragments

AntiLight Chain-Specific Antibodies for Western Blotting after IP

IP免疫沉淀实验

Fluorescent Protein Conjugates (R-PE, APC, and PerCP)

Anti-Fluorescein, Anti-Digoxin, Anti-Biotin, and Anti-HRP

蛋白量少,放大实验体系

 

热点:

骆驼类抗体是研究热点之一,如羊驼抗体。主要原因是骆驼抗体缺少轻链,羊驼外周血液中存在只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区的抗体,称为纳米抗体。相对于人工改造的基因工程单链抗体片段-scFv抗体,该抗体更稳定不容易聚集。如果只克隆其可变区(VHH),其分子量只有15KD,是很多抗体药物研发的首选。

纳米抗体的有点:

1)纳米抗体结构简单,分子量小,更利于表达和使用;

2)更方便再大肠杆菌和各种真核系统中高效大量表达;

3)由于其只有一个结合位点,属于单域抗体,作为诊断试剂由更好的通透性、特异性和检测线性;

4)便于与各种融合蛋白偶联或者更容易被各种标记物标记;

5)更易于制备双功能抗体,更利于靶向药物开发和细胞靶点定向运输。

6)作为药物开发,其对于人免疫原性小,不容易产生免疫排斥

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