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DNA提取试剂盒的操作方法
来自 : 蚂蚁淘

DNA提取试剂盒是根据氯化芐法构建的,能够从样本中提取基因组DNA的试剂盒。氯化苄具有能将含有纤维素等的细胞壁中的羟基苄基化,从而破坏细胞壁的特性。本制品利用了氯化苄的这一特性,将植物样品冻结融解后,再使用PipetTip的尖端将植物样品在Microtube壁上数次按压即可破坏细胞壁。本法与传统方法相比,省去了液氮研磨等烦琐步骤,有利于一次性处理大量样品。而且,本制品经过了改良,热处理时间只需15分钟,使用本制品从实验开始至水相回收只需30分钟时间。得到的基因组DNA可以进行PCR扩增及限制酶处理等。

  • 中文名

  • DNA提取试剂盒

  • 外文名

  • DNAExtractionKit

  • 应用领域

  • 医学

目录
  1. 1保存方式

  2. 2操作方法

  3. 3分类

DNA提取试剂盒保存方式

室温。低温保存可能会有沉淀析出。如果发生析出现象,请于50℃溶解后,再于室温保存。

DNA提取试剂盒操作方法

全套操作约需1小时,分匀浆、细胞裂解、除蛋白、DNA纯化等步骤,详细说明如下。

匀浆和细胞裂解:

使用不同的实验材料需采用不同的匀浆步骤,具体说明如下:

【从动物组织中提取基因组DNA】

使用研钵进行匀浆时:

①取1~100mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中,快速用力展研成匀浆。

注)下列组织请加液氮研磨至粉末状。

A.富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺、淋巴等组织。

B.富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。

C.富含角质蛋白的组织或坚硬的组织(如骨骼)等。

②加入650μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1,温和研磨30秒钟。

注)使用上述①-注)的实验材料时,请在加入SolutionA及RNaseA1后,将研钵置于65℃水浴上研磨1分钟。

③收集650μl研磨好的组织匀浆液移至CollectionTube中。如果匀浆体积不足650μl,请补充SolutionA至650μl,65℃保温5分钟。

使用研磨棒进行匀浆时:

①取1~100mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的CollectionTube中,用研磨棒快速研磨成糊状。

②加入350μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1后用研磨棒快速研磨成匀浆。

③加入350μl的SolutionA将研磨棒上的匀浆冲入CollectionTube中,充分振荡混合后,65℃保温5分钟。

【从植物材料或植物培养细胞中提取基因组DNA】

①按下表称取适量的新鲜植物材料(如选用的是冷冻干燥植物材料,则用量减半),剪成小块放入研钵中,加入液氮,待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。

植物材料种类

植物材料使用量*

植物花、叶片

10~100mg

植物茎

60~240mg

植物根

80~240mg

植物种子

80~240mg

*如选取植物的根、种子等样品时,因其基因组DNA含量很低,需使用超过表格中所示的参数用量,此时请分两管进行步骤1~6的实验操作,在步骤7的操作中再将各管溶液分次加入至同一SpinColumn中过滤,使各管的基因组DNA结合到同一个SpinColumn上。

如从培养的植物细胞中提取基因组DNA,请离心收集2×103~1×107的培养植物细胞,加入150μl水充分悬浮细胞后移入研钵中,加入液氮后快速、用力研磨至粉末状。

注)样品研磨应充分,否则将会严重影响基因组DNA的收率。

②将研钵移至65℃水浴,当样品粉末刚开始融化时,向研钵中加入700μl的SolutionA和1.2μl的RNaseA1,用力碾磨30秒。

③收集650μl研磨好的组织匀浆移至CollectionTube中。如匀浆体积不足650μl,请补充SolutionA至650μl。65℃保温15分钟。

注)处理富含纤维的根/茎等植物材料或富含淀粉、蛋白质的种子等时,可延长水浴时间至60分钟。

【从全血中提取基因组DNA】

①取10~250μl的全血(含抗凝剂)加入至CollectionTube中。

②加入500μl的SolutionA。

③加入1μl的RNaseA1,激烈振荡15秒钟后,冰浴5分钟。

注)人与动物的抗凝全血的一次处理量为≤250μl;禽类、两栖类的抗凝全血的一次处理量为≤10μl。

【从培养细胞中提取基因组DNA】

三.使用悬浮培养的动物细胞时:

①使用CollectionTube收集1×105~1.5×107的细胞悬浮液,5,000rpm离心5分钟,弃上清(细胞培养液)。

②加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞。

③加入500μl的SolutionA和0.8μl的RNaseA1,激烈振荡15秒钟,然后室温静置1分钟。

四.使用贴壁细胞时:

①弃尽培养液,向培养皿中加入650μl的SolutionA,室温静置1分钟。

注)96孔板等的每个孔中一次容纳不了650μl溶液时,请分数次处理细胞。

②用移液枪的枪头吹落贴壁培养细胞,取650μl的细胞悬浮液转移至CollectionTube中。

③加入0.8μl的RNaseA1,激烈振荡15秒钟,然后室温静置1分钟。

2.加入400μl的SolutionB,振荡混合。

3.加入1ml的4℃预冷的SolutionC,充分混匀后,12,000rpm离心2分钟。

4.弃去上层有机相,再加入1ml的4℃预冷的SolutionC,充分混匀后,12,000rpm离心2分钟。

5.弃去上层有机相,然后将水相溶液(无色下层)转移至置于CollectionTube上的FilterCup中,12,000rpm离心1分钟。

注)有机相(上层)带有颜色,请务必除尽,否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。相间沉淀不必考虑,在过滤时将被去除。

6.弃FilterCup,在滤液中加入400μl的DBBuffer,混合均匀。

7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。将上述操作6混合溶液转移至SpinColumn中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。

8.将500μl的RinseA加入至SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。

9.将700μl的RinseB加入至SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。

注)请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB,这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

10.重复操作步骤9。

11.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入50~200μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1分钟。

注)把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。

12.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

如果实验室备有适合于SpinColumn接口的负压装置,可从上述操作步骤6完成以后进行以下操作。

7.将试剂盒中的SpinColumn插到负压装置的插口上,将上述操作步骤6的混合溶液转移到SpinColumn中,开启调节负压装置,缓慢吸走SpinColumn中的溶液(流速控制在1滴/秒)。

8.将负压调至最大,向SpinColumn中加入500μl的RinseA,吸尽SpinColumn中溶液。

9.向SpinColumn中加入700μl的RinseB,吸尽SpinColumn中溶液。

注)请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB,这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

10.重复操作步骤9。然后从负压装置上取下SpinColumn,将其安置于试剂盒中的CollectionTube上,12,000rpm离心1分钟。

11.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入50~200μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1分钟。

注)把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。

12.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

DNA提取试剂盒分类

DNA提取试剂盒主要可以分为以下几大类:小量全血基因组DNA提取试剂盒、中量全血基因组DNA提取试剂盒、组织/细胞基因组DNA提取试剂盒、中量/大量组织/细胞基因组DNA提取试剂盒、全血/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒、CTAB植物基因DNA提取试剂盒、新型植物基因组DNA提取试剂盒、酵母基因组DNA提取试剂盒、M13噬菌体单链基因组DNA提取试剂盒。


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