酶联免疫吸附(ELISA)实验一竞争法测抗原
实验方法原理 | 图1:竞争法测抗原示意图 本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面,我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程,称为包被(Coated),也可叫做致敏。经洗涤后分成两组:一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液,而另一组只加酶标记抗原,再经孵育洗涤后加底物显色,这两组底物降解量之差,即为我们所要测定的未知抗原的量。 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可,因此,对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快,因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。 | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
实验材料 | 血清体液血浆 试剂、试剂盒 | 包被缓冲液抗体球蛋白吐温柠檬酸硫酸洗涤缓冲液 仪器、耗材 | 96孔板酶标比色计移液枪离心管离心管盒 实验步骤 | 一、包被抗体:用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1~10μg/ml),每凹孔加0.3ml,4℃过夜,或37℃水浴3小时,贮存冰箱。 二、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次,每次5分钟。 三、分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2ml,b组只加酶标记抗原液0.2ml,37℃作用1~2小时。(混合液可作成不同稀释度) 四、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次,每次5分钟。 五、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT),室温作用30分钟(另作一空白对照,0.4ml底物加0.1ml终止剂)。 六、加终止剂:每凹孔加2MH2SO4或2M柠檬酸0.05ml。 七、用酶标比色计测定a、b两组OD值,并求出a、b、OD值的差数。 其他 | 一、影响ELISA的因素 1. 试验的重复性(精确度) 有二种方法来检验试验的精确度:通常用变异系数来表示:1、几个样品用ELISA法同时进行多次测定求出CV%;2、不同时间对不同操作者对某几个样进行多次测定求出变异系数。CV是个体参数标准差与平均数的比率。 S/X=CV,CV应低10%,不应大于10~15%。 不论目测或分光光度计测定,均可作一个稀释度或一系列稀释度测定,一般常规诊断只用一个稀释度判断阳性或阴性就可以了,这样比较方便,现在推荐传染病的血清诊断用1:200一个稀释度。有些需要精确定量的,可作一系列稀释度测定。 记录结果有下列几种方法: 1、“+”或“-”:所有超过规定的OD值(如OD,0.4)的标本均属阳性,此规定OD值是根据事先测定大量阴性标本所取得的,此规定值是阴性标本的上限。或者以一组阴性标本OD平均值加2~3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以OD值来表示,如0.4、0.7、1.2,OD值越大,阳性反应越强,但此数值是在固定实验条件下得到的结果,而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示:将标本作连续稀释,最高稀释度能出现阳性反应者(即OD值仍大于阳性阈值,即为该标本的滴度。 4、以“比值”表示:求出被检标本的OD值与一组阴性标本OD值的比值,例如为阴性标本的2倍或3倍,即为阳性,比值小于2.1而大于1.5为可疑,<1.5为阴性。 测定标本OD值-空白OD值 阴性对照OD值-空白OD值 如在此测定时以空白校正“O”点。 5、以“单位”来表示:在测定被检标本的同时,再测定一个含已知单位数的阳性参考血清,用不同稀释度作ELISA检测后,以OD值为纵坐标,单位数为横坐标,画出标准曲线。以后可根据被检标本的OD值,从曲线上找出相应的单位数,再乘于血清的稀释倍数,即可得出被检标本的单位数。 作试验时的阴性参考血清最好不要显色,否则会对结果判断带来困难,特别在目测时,当阳性标本OD值>2.0时,应作适当稀释后再作测定。 2. 对使用仪器要求 所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁,用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要求标准化。 |
免责声明 本文仅代表作者个人观点,与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实,对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺,请读者仅作参考,并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的,应该授权范围内使用,并注明“来源:蚂蚁淘”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
发布于 : 2021-07-22
阅读(147)
▍
相关分类
▍
相关文章
大鼠一氧化氮合酶(NOS)ELISA试剂盒 说明书 实验方法
润裕生物大鼠干细胞因子 肥大细胞生长因子(SCF MGF)elisa试剂盒
转氨酶突然变高是什么原因?_寻医问药网_xywy.com
chemtronics – Automated Driving (Division)
RNAi从理论到实践 (转) 生物科学 小木虫 学术 科研 互动社区
什么叫ELISA法
大鼠催乳素(PRL)ELISA试剂盒 说明书 实验方法
夹心法ELISA检测可溶性白介素2受体实验方法 实验方法 ...
大鼠Tau蛋白(Tau)ELISA试剂盒 说明书 实验方法
大鼠髓过氧物酶(MPO)ELISA检测试剂盒
Instituto Nacional de Contadores Públicos de Colombia
大鼠巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP3α;CCL20)elisa试剂盒品牌 ...
▍
相关问答