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猪肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒

(用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内)

原理

本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗猪SP-A单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的SP-A与单抗结合,加入生物素化的抗猪SP-A,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,SP-A浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中SP-A浓度。

试剂盒组成2-8℃保存)

酶标CoatedWells

96

酶标抗体工作液(EnzymeConjugate

12ml

10×标本稀释液(SampleBuffer

12ml

20×浓缩洗涤液(WashBuffer

50ml

标准品Standards4ng/

2

底物工作液(TMBSolution

12ml

一抗体工作液(BiotinylatedAntibody

12ml

终止液StopSolution

12ml

准备试剂与收集血样

1.收集标本:血清、血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测,2-8保存48小时;更长时间须冷冻(-20-70)保存,避免反复冻融。

2.标准品液配制:使用前加入1ml蒸馏水混匀,配成4000pg/ml的溶液设标准8管,管加入标本稀释液300ul。在第一管中加入4000pg/ml的标准品溶液300ul混匀后用加样器吸出300ul,移至第二。如此反复作对倍稀释,从第七中吸出300ul弃去。第八为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。

4.洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)

检测程序

1.加样:每孔各加入标准品或待测样品100ul,将反应板充分混匀后置37120分钟。

2.洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。

3.每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置3760分钟。

4.洗板:同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置3730分钟。

6.洗板:同前。

7.每孔加入底物工作液100ul,置37暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品2000100050025012562.531.20pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应SP-A含量。

试剂盒性能

1.灵敏度最小的SP-A检测浓度小于16pg/ml

2.特异性:可同时检测重组或天然的猪SP-A不与猪其它细胞因子有交叉反应。

3.重复性:板内、板见变异系数均小于10%。

注意事项

1.以上标准孔及待样品均建议做复孔,每次测定应同时标准曲线。

2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。

3.板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥

4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。

5.本试剂盒仅用于科研,不能用于临床诊断!

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