ELISPOT（enzyme-linked Immunospot）采用定量夹心ELISA法，抗原特异性单抗预先包被在贴有PVDF的微孔板上，适量刺激后的细胞滴加入小孔中，并将微孔板放置于湿润37℃的二氧化碳温箱中孵育一段时间。在孵育的这段时间内，已固定的抗体（在紧靠分泌细胞的周围）与分泌出的被分析者结合。将未结合的物质和细胞洗涤掉之后，加入生物素标记的可与被分析者连接的多克隆抗体。洗涤掉未结合的生物素标记的抗体，加入连接有碱性磷酸酶的亲和素。洗去未结合的酶。假如底物（BCIP/NBT）在有相应细胞因子的位置有蓝黑色的小点，则每个小点代表一个分泌细胞，小点可用自动的ELISPOT阅读仪或用立体显微镜手工计数。ELISPOT操作步骤概述 无菌操作 在板条微孔内包被抗细胞因子的俘获抗体 用蛋白质结合空的细胞位点 在各孔内加入细胞并孵育 　 无需在无菌条件下操作 加入生物素标记的抗体 加入链霉亲和素酶 加入显色底物溶液 风干，避光保存 通过酶标仪或免疫印迹分析仪读出分析结果

为什么选择ELISPOT?ELISPOT斑点酶联免疫分析使细胞因子分泌过程更加形象。因为细胞因子围绕在细胞周围，在被上清液稀释之前，会和邻近细胞表面的受体结合，或者降解。细胞因子和GranzemyBELISPOT实验是最有效的体外监控CD4或CD8T细胞抗原的方法。通过测定单个细胞因子信号及其频率，可以建立具有不同集落大小的特殊T细胞库。ELISPOT实验检测细胞因子的独特优势　☆从1到10，000，000，可以精确测量体外细胞因子的分泌频率，和ELISA以及四聚体染色、细胞内细胞因子染色相比，具有灵敏度高、特异性好的特点。提高灵敏度非常关键，因为体内产生抗原特异性T细胞的频率非常低。☆大批量细胞分析：可以分析上百个样品，检测多种抗原。☆所需细胞浓度低。和其他试验方法相比，ELISPOT方法对细胞浓度没有太高的要求，比如，检测600中不同的抗原或肽段只需要45ml血。☆可以确定CD4或者CD8抗原决定簇。因为实验所需细胞量少，实验灵敏，所有ELISPOT对于决定簇图谱的绘制，肽段文库的筛选是最理想的选择。☆可以建立抗原特异性T细胞亲和函数☆可以研究未经药物处理过的T细胞的实际细胞因子分泌过程，T细胞分泌物下降，则说明T细胞产量减低或者单个细胞分泌功能下降。☆ELISPOT不破坏淋巴细胞活性，可以继续进行细胞克隆以及低温储藏研究☆低温存藏的人淋巴细胞可以继续保持生物学活性，可以重复实验步骤。ELISPOT是现今研究T细胞功能，进行T细胞诊断最有力的工具，ELISPOT的研究已经成为一门科学。ELISPOT分析仪专利草案在病理学教授PaulV.Lehmann博士带领下，众多学者共同在CWRU大学通过了新一代ELISPOT分析仪的专利认证。最初ELISPOT是为了检测B细胞分泌抗体而问世的，因为T细胞分泌细胞因子而B细胞产生抗体，新一代的ELISPOT增加了检测T细胞分泌细胞因子的功能。ELISPOT分析具有精确性、客观性，可重复性以及自动化特点，改变了以往ELISA的耗时，结果不客观的缺点。ELISPOT分析仪的出现解决了以下问题☆哪些斑点是抗原特异性T细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有T细胞研究价值）☆斑点大小的意义☆在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸☆如何从单个细胞基础上分析☆实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？☆几次重复实验才能使结果更有意义？ELISPOT：世界一流科学家辛勤劳动的果实ELISPOT分析仪的最初研究在CWEU大学开始，由26名工作人员，15个科研工作者，和许多来自BD、Pharmingen的科学工作者共同努力下研制成功的，为此CTL也成为美国国立卫生院免疫耐受网络（ITN）指定的参考实验室，专门对各种ELISPOT临床试验结果进行测试。经科学认证的ELISPOT分析仪包括三个分析模式，适用于客户不同的消费水平、研究目的、外围设备，附属软件和数据处理方法。另外，CTL提供图像分析服务，ELISPOT有自己的网上实验室，可以提供网络培训以及为临床试验项目按照合同约定提供研究服务。EILISPOT：科学**自从CTL发起ELISPOT**以来，很多人在借鉴我们的成功经验。作为创始人，CTL致力于开创ELISPOT新方法并将其提高到科学的高度。

关于Elispot随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。2.ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过北京赛智创业生产的ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。4.捕获抗体为BD、R&D、Mabtech、Diaclone生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。ELISPOT检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过北京赛智创业科技公司生产的ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。Elispot的出现解决了以下问题：1.哪些斑点是抗原特异性T细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有T细胞研究价值）2.斑点大小的意义3.在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸4.如何从单个细胞基础上分析5.实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？6.几次重复实验才能使结果更有意义？为什么要使用ELISPOT？Elispot分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。使用ELISPOT的好处1.Accurateexvivofrequencymeasurementsdowntotheone-in-one-millioncellrange.ThisresolutionisordersofmagnitudehigherthanthatreachedwithintracellularcytokineortetramerstainingorbyELISAmeasurements(seeFigure1).Suchaddedsensitivityiscritical,sinceantigen-specificTcellstypicallyoccurinlowfrequenciesinvivo.2.High-throughputTcellanalysisbecomesfeasIBLe.Atrainedreferencelaboratoryteamcantesthundredsofsamplesforreactivitytodozensofantigens.3.Fewercellsarerequiredcomparedtoothercellularassays.Forexample,45mlofbloodissufficientfortestingreactivityto600differentantigens/peptides.4.DeterminantstargetedbyCD4orCD8cellscanbedefined.Becausefewcellsareneededandtheassaycanbeperformedinhigh-throughputmode,ELISPOTassaysareidealforscreeningpeptidelibrariesfordeterminantmapping.5.ThefunctionalAvidityofantigenspecificTcellscanbeestablished.Thisisreflectedbythe50%maximallystimulatingpeptidedose.6.Theactualsecretoryprocessofpharmacologicallyuntreatedcellscanbestudied.Ifdecreasednetproductionisseen,thedistinctioncanbemadeastowhetherfewercellsproduceorthereisreducedpercellproductivity.7.LymphocytessurvivethetestinginELISPOTassays.Thispermitspost-assaypropagationforfurtheranalysis,cloning,orcryopreservation.8.Cryopreservedhumanlymphocytescanbetestedwithoutlossoffunction.Pre-andpost-treatmentsamplescanbetestedsidebysideandresultscanbereproduced.ELISPOT技术应用领域自身免疫检测、器官移植、疫苗和药品的研发与检测、T细胞功能研究、肿瘤研究、传染病的研究和检测、病毒研究等等。目前CTL公司使用ImmunoSpot技术的部分研究领域1.Single-CellResolution/ExactFrequencyMeasurementsofAntigen-SpecificTcellsExVivo.2.MeasuringType1/Type2Immunity3.CognateCytokineProductionbyTCellsvsBystanderCytokineProduction4.MeasurementsofFunctionalTCellAvidity5.CytokineCo-Expression/TwoColorELISPOT6.SpotSizeDistribution7.DeterminantMapping/HighThroughputScreening8.AssaytoAssayReproducibilityofExVivoMeasurementsonPBMC9.Freshvs.CryopreservedhumanPBMC10.CD8+TcellsandGranzymeBELISPOT11.ELISPOTWithCellsOtherthanHumanPBMC,orMurineLymphNode/SpleenCells12.VaccineandAdjuvants13.TumorImmunology14.TransplantationImmunologyELISPOTAssaysVisualizetheSecretoryProductofIndividualCellsTheseassaysareexceptionallysensitiveastheproductiscaptureddirectlyaroundthesecretingcell,beforeitiseitherdilutedinthesupernatant,capturedbyreceptorsofadjacentcells,ordegraded.CytokineandGranzymeBELISPOTassayshaverecentlyemergedasthemostsensitiveandrobusttechniquefordirectexvivomonitoringofantigen-specificCD4orCD8Tcells.Bymeasuringthefrequenciesandcytokinesignaturesofindividualcells,theyestablishtheclonalsizeandeffectorclassofthespecificTcellpool.

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