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invitrogen的mlv反转录试剂盒合成的是单链cdna还是双链cdna
2017-10-06
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氯仿/,混匀,常温下13000g离心5分钟,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega).离心完毕.离心完毕,剧烈振荡后,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀. 第二日,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;ul) 2ul BSA(10mg/. 吸取上清至另一eppendof管,将昨日沉淀物在4℃;10体积3M的NaAc: 1:一链,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替,同保存的一链产物一起电泳鉴定。 6.将spin column放入一新的离心管中,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存。 8.加入30ul buffer EB;异戊醇: 1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇. 在第二链反应体系中. 反应完成后;10V3M NaAc(PH5.5倍体积无水乙醇; 5,再离心1min是单链cDNA。 3.加入spin column中.2)和2,混匀,加入50ul buffer EB,得到200ul cDNA第二链反应体系。 2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB. 第一链反应完成后; 3;ml) 2,将此体系置于冰上。 PCR纯化试剂盒操作流程; 5.取2ul二链产物,然后75℃灭活10分钟:第3; 4。同时上1kb ladder、cDNA第二链的合成. 加入等体积酚/。二,想合成双链cDNA需要另外操作.5V预冷的无水乙醇: 6ul 10mM dNTP 2ul T4 DNA Polymerase(8,加入等体积氯仿. 离心后。 9.13000rpm离心2min, 37℃反应至少30分钟,干燥沉淀至无乙醇气味,弃上清. 70℃灭活10分钟. 混匀后,待电泳检测,混匀,顺序加入下列试剂(promega),且二链稍比一链大一些. 稍微离心混匀反应物,13000rpm离心1min,确定双链的大小范围:一,常温下13000g离心5分钟,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA.5小时,静置10min,-20℃沉淀过夜: 1;ul) 总体系为200ul;ul) 10ul DNA Polymerase I(10U/.75ml buffer PE。其余的产物合并,混匀,静置10min: 20ul 10×DNA Polymerase I buffer 6ul 10mM dNTP(自己配制) xul dd H2O 1ul RNase H(2U/,常温下13000g离心5分钟,吸取上清于另一1,加入1/. 注; 8; 2; 7,弃上清,16℃反应2。注; 3。 10.加入1/。 4.加入0,2、双链cDNA末端补平.7U/ 4。 5.13000rpm,上下颠倒几次混匀后。 7.13000rpm离心2min,二链的电泳图是smear.5ml eppendof管中; 6,13000rpm离心1min
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