[求助]【求助】刚开始接触荧光定量PCR，请大家帮帮忙

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2021-08-12

问题描述：

刚开始接触荧光定量－PCR，有很多问题不是很明白，脑子比较乱，我做了RT-PCR检测一目的基因表达，扩增产物清晰，明确，其长度与Marker对照相吻合，老板叫我对其测序，然后在进行荧光定量检测。
⑴测序是为了验证扩增产物是否为自己的目的产物，既然我的产物长度符合要求，那么有必要进行测序吗？②对于荧光定量检测，我先前的那对引物可以接着用吗？③如用ABI7700采用Taqman探针法检测，探针的设计是自行用软件（如primer5.0）或参考文献提交公司合成（像PCR引物合成）那样吗？④看到有的文章介绍，探针是国外的、国内的，这是什么意思？依我的理解：就像PCR引物合成，只要合成正确，荧光标记完好，国外国内不都一样吗？⑤看到有相应试剂盒提供，其提供的东西有哪几样？是不是探针，引物都包括了，对于那些常见的基因都有相应的试剂盒卖吧，关键是价钱贵吗？
看到一个同事做一课题就是设计荧光定量PCR检测某产物，结果半年也没搞出来，令我感到很生畏。现在还有很多临床病原微生物的荧光定量检测还未成功，有的还需优化，是不是设计较困难，哎呀，还未做，就感到力不从心了，大家帮帮我

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huixu

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我接触的时间也不长，可以交流一下经验。（2）对于荧光定量检测，先前设计的引物应该可以适用。如果采用SYBR Green法，没太大问题，但用TaqMan探针法的话，就要对引物及探针进行评估。（3）如果找公司合成探针的话，就可以让公司给设计，只要提供模板即可，反正又不收费，而且人家有经验。当然自己设计也可以了。（4）确实像你说的，国外和国内合成都可以，只是现在有些大公司的跟踪服务好一些，会减少摸索试验条件的时间等。以我们这的试验结果来看，国内的探针设计的也都还不错。（5）试剂盒里只有酶等反应体系，不包括探针和引物，这些都是需要根据你的模板具体进行设计的。而试剂盒是通用的，比如SYBR Green试剂盒啊，里面就包括酶、SYBR Green染料等，按照说明加入模板和引物就可以了；探针类的试剂盒包括酶等，加入模板、引物和探针可以进行反应。价格还可以，以一般最小包装来计，国内的1500左右，国外的2000或以上吧。其实只有把试验理顺了，荧光定联PCR没有那么可怕，祝你成功！

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草根

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偶来答答～～1.片段大小一致应该是跑Marker得出的结论吧？这个只能是个大致值，并不能肯定和你所需要的片段完全一致，就算一致，也有可能运气不好是非特异扩增。测序是确定片段是否是你所需的唯一、最终的金标准。2、3.如果以前那对引物扩增片段在250以内的话，可以用sybrgreen法做荧光定量。如果taqman探针法的话，就要重新设计。taqman探针可以用ABI公司的primerexpress设计（并非primer5），然后给公司合成。当然参考国外文献上的引物探针也未尝不可，只是有些文献如果设计到知识产权的话，作者可能会更改引物序列。4.国内国外引物探针应该差不多。但现在很多国内的什么什么公司其实就是国外公司的代理～～5.偶没用过试剂盒。不过有些专门针对某些病原微生物的，其中是有相应的引物探针的，如乙肝定量检测试剂盒。sybrgreen的试剂盒如huixu所说，可能有的有rox试剂。其它的就由其它战友补充了～～6.病原微生物的定量检测研究的确很多，难度也大些。主要是个检测方法的特异性和灵敏度的问题。因为病原微生物变异大，而定量方法比较灵敏，尤其taqman探针序列上的变异就可能导致检测结果的遗漏，所以都还需要不断摸索～～

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caifeng

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谢谢楼上两位的热心解答

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