2018年苏州蚂蚁淘生物科技有限公司正式成为Clodronate liposomes的授权代理商,负责该公司巨噬细胞清除试剂在中国大陆的市场和销售工作,此前使用的是陈旧的资料,今天蚂蚁淘重新整理了一份Clodronate liposomes最新说明书,以FAQS的形式展示如下:

1、是否有可能在体外使用氯膦酸脂质体清除巨噬细胞?

    是的,在体外消耗巨噬细胞是可能的,但请记住,这种方法特别适用于“体内”研究。原因是Clodronate从死去的巨噬细胞释放或泄漏培养基中发布的脂质体(依赖于介质的组成)不能逃离媒介而Clodronate,一旦“体内”发布,半衰期很短,由于其快速切除肾脏。游离氯膦酸盐分子不容易进入细胞,因为它们很难通过细胞膜(以及脂质体磷脂双层膜)。然而,如果它们留在周围的培养基中,它们可能会慢慢积累成细胞。

    参见参考文献Claassen, I., Van Rooijen, N., and Claassen, E., 1990. A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogenous cell populations ‘in vitro’, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. J. Immunol. Meth.. vol. 134. pp. 153-161. (#32).


2、清除肺泡巨噬细胞如何给药?

    脂质体既可经鼻给药,也可经气管给药。

    参见参考文献:DeHaan, A., Groen, G., Prop, J., Van Rooijen, N., Wilschut, J. 1996. Mucosal immunoadjuvant activity of liposomes: Role of alveolar macrophages. Immunology, 89; 488-493)
The difference may be that all liposomes once admiNISTered intratracheally, arrive in the lung (alveoli), whereas liposomes admiNISTered intranasally (if admiNISTration is not well performed


3、动物注射氯膦酸脂质体后死亡的原因?

    A、动物在注射过程中死亡

    这可能是由于注射了非均匀悬浮的脂质体

    为了得到均匀的悬浮体,在注射前应摇动或搅拌脂质体的悬浮体。一段时间后脂质体会沉淀。如果注射时间太长,它们甚至可能沉淀在注射器中,如果更多的动物使用相同的注射器注射,这也可能导致不同的剂量,因为第一个动物将得到更多的(部分沉淀)脂质体比最后一个动物。

    另一个原因可能是注射过快。如果从冰箱中取出脂质体,它们至少应该有时间达到室温。

    B、动物在注射几天之后死亡

    这可能是由于微生物污染和/或在注射前不久或注射期间激活动物造成的。请记住,巨噬细胞的缺失可能导致病毒滴度、细菌或酵母菌的增加。


4、脂质体标签如何应用?

    对照脂质体可能被标记,例如用荧光染料DiI,因为它们不影响巨噬细胞。因此,该标签将显示组织内脂质体的分布模式及其被巨噬细胞摄取。我们通常不发送带有DiI标记的氯膦酸脂质体,原因如下:氯膦酸脂质体会杀死巨噬细胞;因此,一旦巨噬细胞死亡,DiI标签将被重新辐射,而该标签不再代表脂质体的实际分布。因此,脂质体要么含有氯膦酸盐来消耗巨噬细胞,要么含有DiI来显示哪些巨噬细胞正在吞噬脂质体(或者脂质体是否能够到达待研究的巨噬细胞)。组合可能导致误解。


材料:

PBS:磷酸0012;0,8% NaCl, pH 7,4


DiI的解决方案:

将1ml乙醇100%添加到2,5 mg DiI(分子探针文章编号D-3911)在35千赫的水浴中超声1分钟(嵴应溶解)


方法:

每毫升脂质体悬浮液中加入10微升DiI溶液;

彻底摇动脂质体悬浮液;

室温(黑暗)孵育10分钟;

以20.000 xG离心脂质体10分钟;

移除上层清液;

加入无菌PBS,复苏;

以20.000 xG离心脂质体10分钟;

将无菌PBS添加到原始卷中;

在4摄氏度的温度下储存标记为黑色的脂质体


5、静脉注射Clodronate liposomes后大鼠脾脏/肝脏中的ED1+细胞并没有完全消失?

    大鼠中成熟的巨噬细胞呈现ED1和ED2双阳性,但是有一些没有吞噬功能的或者吞噬作用小的前体细胞也是ED1+,但是呈现ED2-。因此,所有ED2+的细胞都可以被完全清除,但是ED1+的细胞却只能被部分清除,清除的比率取决于前体/成熟巨噬细胞的比例。


6、Clodronate liposomes失败的表现?

    请注意,氯膦酸酯脂质体和对照脂质体都是大批量生产的。这些母批得到一个独特的代码,并检查氯膦酸盐的含量和可能的污染后的准备。这些批次的样品被送往世界各地的几个(ca 30)不同的实验室。因此,如果我们收到一封电子邮件,报告与脂质体缺乏活性或污染有关的问题,我们将检查是否有其他来自实验室的投诉,这些实验室确实收到了与发给您的样品相同批次的样品。如果没有,我们当然会尽快通知您未来的投诉将到达我们。

    它们失效的具体地理相关原因可能是运输或储存期间的极端温度造成的。脂质体在运输或储存过程中,任何时候都不应冷冻或加热至摄氏30度以上。

    此外,在选择给药途径时,应确保脂质体能够畅通无阻地接近即将耗尽的吞噬细胞(见参考资料一章)。请记住,脂质体是颗粒,不会穿过正常毛细血管内皮。

    此外,巨噬细胞的特异性标记物也需要从组织中确定它们的消耗。非特异性标记的使用可能影响结果的可靠性。


7、如何处理氯膦酸脂质体和控制脂质体?

    氯膦酸脂质体和对照脂质体的悬浮液应按原样使用,不应稀释或进行任何其他处理。如果在到达后的几天内不使用,可以将其保存在摄氏4度。从未冻结脂质体! !

    脂质体(作为颗粒)容易沉淀。因此,在将悬浮液分成更小的体积或注射到动物体内之前,应轻轻摇动悬浮液,以便再次获得均匀的悬浮液,并使脂质体在整个悬浮液中均匀分布。如果储存在4摄氏度,脂质体应该有机会达到室温之前注射。永远不要注射冷脂质体!


8、增加氯膦酸脂质体的浓度的相关问题

    A、是否可以提高脂质体中氯膦酸盐的浓度?

    不,氯膦酸盐在脂质体内的水舱中的浓度受氯膦酸盐溶解度的限制,在标准的氯膦酸盐脂质体悬浮液中保持最大浓度。

    B、是否有可能通过增加每毫升混悬液中脂质体的数量来获得注射剂量?

    这是不推荐静脉注射,因为流动性会降低,这可能导致堵塞毛细血管。然而,它也可以尝试,例如在松散编织的组织中局部注射,或在脂质体逐渐进入循环之前从脂质体被过滤的腹腔内注射。

    C、氯膦酸盐脂质体的用量是否可以提高

    静脉注射每10克体重不应超过0.1毫升。然而,腹腔内注射时,注射量可大大增加。对于皮下注射,最大注射量取决于注射部位的储存能力。

    D、是否可以将游离的氯膦酸盐与体内用脂质体包被的氯膦酸盐进行效果对比?

    Clodronate体内的半衰期是以来的15分钟,是很有区别的注射高剂量的免费Clodronate,这将减少到一半的原始值每15分钟,注射相同剂量的脂质体将从死去的巨噬细胞释放缓慢。

    在第一种情况下,有一个高浓度,将迅速减少。在第二种情况下,浓度要低得多,但可以维持更长的时间。


9、巨噬细胞耗竭是否有可能维持较长时间?

    在正常情况下,即在没有某些微生物产物激活的情况下,巨噬细胞群,如肝脏中的库普弗细胞和脾脏中的红髓巨噬细胞,在约1周后开始重新填充它们的隔室。

    其他巨噬细胞群,如脾脏边缘嗜金属巨噬细胞和边缘区巨噬细胞(静脉注射后)和淋巴结巨噬细胞(引流区皮下注射后)在较长时间内都不存在(见相关文献底稿)。

    为了实现SCID小鼠巨噬细胞的长期耗竭,Fraser等人(Blood, 86;尝试了几种注射方案,其中,一次未稀释的氯丙酸脂质体注射后,随后每5-7天稀释一次氯丙酸脂质体。

    然而,我们应该记住巨噬细胞调节各种非吞噬细胞的功能。因此,它们的长期缺失可能最终导致功能不活跃,甚至这些非吞噬细胞的消失。


10、有可能去除巨噬细胞前体吗(单核细胞)?

    而静脉注射Clodronate脂质体没有成熟的巨噬细胞如肠道,由于脂质体不能跨毛细血管的血管内皮,Galeazzi et al . (Am J. Physiol. 278 G259-G265, 2000, 见还在手稿)描述的影响通过静脉注射Clodronate脂质体的炎症诱导招聘和渗透F4/80阳性细胞的小鼠空肠。关于这个问题,以下几点很重要:巨噬细胞(单核细胞)的前体被招募到例如炎症区域,循环中的氯膦酸脂质体似乎耗尽了。在这种情况下,几次注射氯膦酸脂质体后不久,必须给予对方,因为1。脂质体在循环中存活时间不长。相对于成熟的巨噬细胞,新的单核细胞可以在较短的时间内被招募。在Galeazzi等人的研究中,给予氯膦酸酯脂质体4小时。在感染前、感染后1、2、4天内,应保证尽可能多地消耗所招募的前体。-显然,他们得到了大量的,在他们的情况下,也有足够的损耗,但几乎完全的损耗从来没有报告过。-在更多的研究中,氯膦酸脂质体的作用只能通过假设在循环或单核/内皮相互作用水平上对巨噬细胞前体的作用来解释。关于血脑屏障(BBB),后者的作用可能是通过将甘露糖残基掺入含脂质体的氯膦酸盐中来介导的,Huitinga等(J. Exp. Med. 172; 1025-1033, 1990)描述了甘露醇酯类氯膦酸脂质体在实验性变应性脑脊髓炎(EAE)模型中的作用。——然而在Clodronate脂质体的研究多次(每周2次)和静脉注射给正常小鼠,成熟的巨噬细胞在各种器官血管障碍防止直接进入成熟的巨噬细胞,并没有耗尽即使在一个月之后,强调单核细胞维持正常营业额招募巨噬细胞在这些器官,没有受到明显影响。


    请同时参阅新闻部分:

Blood monocytes (the precursors of mature resident macrophages) can be depleted by intravenous injection of Clodronate liposomes.
In: J. Immunol. 2004 Apr 1;172(7):4410-7.
Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response.
by: Sunderkotter C, Nikolic T, Dillon MJ, Van Rooijen N, Stehling M, Drevets DA, Leenen PJ.


11、生产及装运时间表?

    订单在周一、周二和周四发货。通过电子邮件发送的采购订单可能需要几天的时间来处理。

    在此之后收到的订单最早将于下周发货。尽管我们通常准备的脂质体悬浮液比满足所有要求所需的多一点,但我们每周的生产计划都是根据这些要求制定的。

    如果你想确定脂质体的存在,当你在进行中的实验中需要这些时,你应该至少提前两周订购。更好的方法是在脂质体已经储存在冰箱里的时候开始实验。虽然我们通常每周发货,但疾病或其他不可预见的情况可能会打断这个过程!

    如果您的订单在 2周内没有到达,有两个主要原因。

1. 该包裹被您的组织拒绝,因为您的名字不为内部分发邮件的人所知,或者您的地址不完整。

2. 另一个人已经接受了这个包裹,但没有告诉你这件事。如果这种情况不止一次发生,你的账户就会被封,直到一切都解决了,因为太多的时间和材料都因为这些原因被破坏了。