| TEM Diameter | Size Distribution (CV) | Example Certificate of Analysis(How do I read this?) |
|---|---|---|
| 5 nm ± 1 nm | ≤ 18% | Download Example CoA |
| 7 nm ± 2 nm | ≤ 12% | Download Example CoA |
| 10 nm ± 2 nm | ≤ 12% | Download Example CoA |
| 15 nm ± 3 nm | ≤ 12% | Download Example CoA |
| 20 nm ± 3 nm | ≤ 15% | Download Example CoA |
| 30 nm ± 3 nm | ≤ 15% | Download Example CoA |
| 40 nm ± 4 nm | ≤ 15% | Download Example CoA |
| 50 nm ± 4 nm | ≤ 15% | Download Example CoA |
| 60 nm ± 4 nm | ≤ 15% | Download Example CoA |
| 70 nm ± 5 nm | ≤ 15% | Download Example CoA |
| 80 nm ± 5 nm | ≤ 15% | Download Example CoA |
| 100 nm ± 5 nm | ≤ 15% | Download Example CoA |
Note: approximate ranges below are dependent on diameter
- Endotoxin Concentration: < 2.5 EU/mL (< 5.0 EU/mL for ≤ 20 nm sizes)
- Hydrodynamic diameter (DLS): TEM diameter plus 5 to 55 nm
- Zeta potential: –5 to –45 mV
- pH of solution: 4.5 to 7.5
- Particle surface: PVP 40 kDa
- Solvent: Milli-Q Water
- Peak wavelength (λmax): 510 to 565 nm
ebiomall.com
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1，测序技术的改进：全基因组主要应用的是illumina的Hiseq X10的测序平台，该平台在图片信息处理和flowcell上都有很大的改进（原来是平板上长簇，现在上面有小孔），另外在扩增的技术上也有一点改进（RPA扩增技术）。以上几点使得数据的通量大大调高。所以相应的测序价格也会降低。
2，市场占有策略：这一点我个人理解比技术更新更重要，illumina的战略思路，占有测序市场。其实illumina的Hiseq X10的测序平台试剂要比其他平台的试剂便宜很多。不过这个平台签有协议，只能做人的全基因组重测序项目。
2016年02月01日发布
关于公布注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录的通知
为配合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）的实施执行，现将供注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品形成目录，公布如下。
注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录（第一期）
序号名称品种编号供应情况1促甲状腺素（TSH）免疫测定用国家标准品150530正常供应2促黄体生成素（LH）免疫测定用国家标准品1505313人绒毛膜促性腺激素β亚单位（hCG-β）免疫测定用国家标准品1505354人胎盘泌乳素（HPL）免疫测定用国家标准品1505365甲胎蛋白（AFP）免疫测定用国家标准物质1505426前列腺特异性抗原（PSA）免疫测定用国家标准物质1505437游离前列腺特异性抗原（f-PSA）免疫测定用国家标准品1505448三碘甲腺原氨酸（T3）免疫测定用国家标准品1505509甲状腺素（T4）免疫测定用国家标准品15055110反三碘甲腺原氨酸（rT3）免疫测定用国家标准品15055211胰高血糖素（Glucagon）免疫测定用国家标准品15055412人绒毛膜促性腺激素（HCG）免疫测定用国家标准品15055513淋病PCR试剂盒质控参考品21001514结核分支杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品23003015结核分支杆菌利福平耐药基因检测试剂用国家参考品23003316结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品23003417测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品36000718人脲原体核酸检测国家参考品36000919第一代H7N9禽流感病毒核酸参考品37000120EB病毒衣壳抗原IgA抗体国家参考品37000221甲型流感病毒抗原检测试剂国家参考品37000322乙型流感病毒抗原检测试剂国家参考品37000423甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品37000624扎伊尔型埃博拉病毒核酸检测试剂国家参考品37001025甲型流感病毒核酸检测试剂国家参考品37001126乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品37001227甲/乙型流感病毒抗原检测试剂国家参考品37001328甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂国家参考品37001429抗HTLV抗体国家参考品220003限制供应，每企业只供应2套/年30HIV抗体国家参考品22000931SARS病毒抗体IgM国家参考品22001032SARS病毒抗体（总抗体或IgG）国家参考品22001133HIV-1RNA国家参考品22001734HIV-1耐药性分析试剂国家参考品22001835HIV抗体尿液快速检测试剂国家参考品22002036乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）国家参考品30000337乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）国家参考品30000538乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）国家参考品30000639乙型肝炎病毒核心抗体(Anti-HBcAb)国家参考品30000740戊型肝炎病毒IgM抗体国家参考品30001141戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品30001442丙型肝炎病毒抗体国家参考品300010限制供应，每企业只供应1套/年
注：1.相关品种电子版说明书可到中国食品药品检定研究院网站http://www.nifdc.org.cn/bzwz/CL0481/,点击目录查询，进行在线浏览。
2.限制供应是指仅供给相关体外诊断试剂生产企业。
二〇一六年二月一日
正向测不通，可能是因为：
1、你的模板比较困难，比如GC含量局部比较高，形成发夹结构，或出现连续的G、C，也可能是连续的C、T。而生工一板要做384或96个反应，用的PCR条件是统一的，不可能兼顾到你的序列的特殊情况，因此你的序列PCR不出来
2、PCR纯化试剂盒有问题，可以考虑换纯化试剂盒。
3、测序时进样太多或太少
解决方法：
1、你可以试试用载体上的通用引物进行测序
2、已经设计出来的序列上设计一段引物，进行walking
摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程
生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术
第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）.并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。
图2：Sanger法测序原理
第二代测序技术
总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5，以下我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。
图3.测序成本的变化
Illumine
Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的2,4。这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为以下4步，如图4.
（1）DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。
（2）Flowcell
Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。
（3）桥式PCR扩增与变性
桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。
（4）测序
测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。
图4.Illumina测序流程
Roche454
Roche454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理是（图5abc）2：
（1）DNA文库制备
454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库（图5a）。
（2）EmulsionPCR（乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）
454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。
乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。
这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。
（3）焦磷酸测序
测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。
测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。由于454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同，它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。
图5.Roche454测序流程
Solid技术
Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序（图6）2,4。它的原理是：
图6-a.Solid测序技术
（1）DNA文库构建
片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。
（2）EmulsionPCR
Solid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsionPCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图6-a）。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
（3）连接酶测序
这一步是Solid测序的独特之处。它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6-a）。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图6-a和图6-b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾后，要将新合成的链变性，洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基（图6-a.8）。也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3’端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成，依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均被检测了两次。该技术的读长在2×50bp，后续序列拼接同样比较复杂。由于双次检测，这一技术的原始测序准确性高达99.94%，而15x覆盖率时的准确性更是达到了99.999%，应该说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。但在荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误。
图6-b.Solid测序技术
第三代测序技术
测序技术在近两三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。
其中PacBioSMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想5，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是：DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记4种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBioSMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。小孔直径有考究,如果直径大于微波波长,能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理）,从而可起保护作用。同理,在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔,即ZMW(零模波导孔),外径100多纳米,比检测激光波长小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围(体积20X10-21L)里,正好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域,孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中,从而实现将背景降到最低。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息（图7）。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%,但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。
图7.PacBioSMRT测序原理
OxfordNanoporeTechnologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术5。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基（图8）。
该公司在去年基因组生物学技术进展年会(AGBT)上推出第一款商业化的纳米孔测序仪，引起了科学界的极大关注。纳米孔测序（和其他第三代测序技术）有望解决目前测序平台的不足，纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端;数据可实时读取;通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成);起始DNA在测序过程中不被破坏;以及样品制备简单又便宜。理论上，它也能直接测序RNA。
纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。并且改方法的测序准确性可达99.8%，而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。但目前似乎还没有应用该技术的相关报道。
图8.纳米孔测序
其他测序技术
目前还有一种基于半导体芯片的新一代**性测序技术——IonTorrent6。该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列（图9）。这一技术的发明人同时也是454测序技术的发明人之一——JonathanRothberg，它的文库和样本制备跟454技术很像，甚至可以说就是454的翻版，只是测序过程中不是通过检测焦磷酸荧光显色，而是通过检测H+信号的变化来获得序列碱基信息。IonTorrent相比于其他测序技术来说，不需要昂贵的物理成像等设备，因此，成本相对来说会低，体积也会比较小，同时操作也要更为简单，速度也相当快速，除了2天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成，不过整个芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常适合小基因组和外显子验证的测序。
图9.IonTorrent
小结
以上，对各代测序技术的原理做了简要的阐述，这三代测序技术的特点比较汇总在以下表1和表2中。其中测序成本，读长和通量是评估该测序技术先进与否的三个重要指标。第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，其测序核心原理（除Solid是边连接边测序之外）都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并要保持二代技术的高通量，低成本的优点。
表1：测序技术的比较
表2：主流测序机器的成本测序比较
以下图10展示了当前全球测序仪的分布情况。图中的几个热点区主要分布在中国的深圳（主要是华大），南欧，西欧和美国。
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直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.
第一部分 基因组DNA的提取.
这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.
我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.
6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液.
7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化.
8：50℃避光水浴16h.
一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适.
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug.
2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确.
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收.
4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全.
第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积.
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.
5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥.此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态.
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min.
7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul.
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min.
4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右.
5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说.不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧.
6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀.有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验.如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）
7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀.不必吸净.
8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min.离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍.此为洗涤步骤,共2次.
9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀.至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验.
10：-20℃保存DNA溶液.
此步细节：
1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用.
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出.
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便.
此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了.
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题.如果不是这样,还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询.查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强.我也是按此行事,算比较顺利.
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择,可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.
3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min.其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.
4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递.
这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验.有疑问处,请大家指出,交流.今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分.
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性.
3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤.
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的.
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度,过夜.
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；
3）42度, 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；
7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低.
3：取白斑,划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区,进行标记.根据需要,一般一板作50个克隆没有问题.
针头挑白斑划2道于板上相应区域内.
37度,孵箱过夜.
4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.
这一部分的细节：
1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个.
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