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步骤
A. 真核细胞和组织
自己需要的材料:
β-巯基乙醇、70%乙醇(DEPC水配置)、除RNase的枪头和EP管。
材料的最佳量
想得到最佳的产量和好的Hibind RNA柱的纯化效果,选用正确的细胞和组织量是最重要的。Hibind RNA柱的最大处理量是可变的,根据细胞和组织的类型。最大的结合能力是100ug的RNA。TRK裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg的组织。
细胞的步骤
1. 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞(≤1*107),使细胞团松散,轻轻弹EP管或者用枪头吹旋,再用漩涡振荡混匀。
a) 使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β-巯基乙醇。
b) 如果是单层的组织培养细胞(成纤维细胞,内皮细胞等),可以直接在细胞培养器里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加700ul的TRK到T35细颈瓶或250px的培养皿中,更小的培养器加500ul的TRK。将液体布满整个器皿表面,确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP管中。
c) 如果细胞是悬液培养,收集细胞(≤1,500rpm or 400*g)*5min,弃上清,加入TRK裂解液,漩涡振荡混匀,转移到1.5ml EP管中,进行步骤2。
2. 匀浆化裂解产物
“裂解和匀浆化样品”-第四页有详细的说明,如果细胞≤1*105,漩涡振荡1min。不完全使样品匀浆化会显著的减少RNA的产量还容易造成柱子堵塞。
a) 用匀浆器30 s,使样品匀浆化。
b) 用钝的针头的注射器(0.9mm直径),至少吹打5次是样品匀浆化。注射器要除RNase。
3. 将匀浆后的裂解产物转移至Homogenization Spin Column中,离心,≥1,4000*g, 3min,室温。将离心收集的流出液转移到新的EP管中。转到总RNA分离中第4步。
组织的步骤:
1. 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞(≤30mg),使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β-巯基乙醇。
500ulTRK裂解液最大裂解能力30mg,难破碎的组织大于20mg就用700ul的TRK裂解液。当组织量超出建议的最大量时,也不要超过40mg。
组织样品匀浆化参照第四页选择一种方法只用,除非是使用液氮,
2. 离心,≥1,5000*g, 5min, 室温。
3. 转移上清至,Homogenization Spin Column中,离心,≥1,3000*g, 3min,室温。将离心收集的流出液转移到新的EP管中。
总RNA分离:
4. 在裂解产物中加入50%体积(250ul-350ul)的无水乙醇(96%-100%)混匀,漩涡振荡20s。
5. 样品转移到Hibind RNA Mini column上,离心管的最大容量为750ul,加完乙醇后可能会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。室温离心,10,000*g,0.5-1min。弃去流出液(透过柱子流出到离心管里的液体)。
6. 将柱子放在一个新的2ml收集管中,加上300ul RNA wash buffer I。室温离心,10,000*g, 0.5-1min。同样弃掉流出液。
7. DNase I 消化(选择性)
在我的实验中没有做这一步。
8. 将柱子再放到一个新的2ml收集管中,加入400ul RNA wash buffer I, 室温离心,10,000*g, 30s,弃流出液。
9. 将柱子放到2ml收集管中,加入500ul RNA wash buffer II(乙醇稀释过的),室温离心,10,000*g, 30s,弃流出液。注意:使用前RNA wash buffer II 必须要用无水乙醇稀释(48ml),按照标签上的说明。
10. 用500ul RNA wash buffer II洗涤一次柱子,同上一步骤一样。室温离心,10,000*g, 30s,弃流出液。然后在空收集管中,以最大转速离心柱子,≥12,000*g, 2min, 室温,使的HiBind 基质完全干燥。
11. 转移柱子到一个新的1.5ml的Ep管中,(试剂盒中没有提供),加入50-100ul的DEPC水洗脱柱子(试剂盒中提供)。确保水直接加到了柱子的基质上。10,000*, 1min, 室温。如果RNA的总量大于30ug,可以进行二次洗脱。
注意:可以选择性地,用大一点的体积洗脱RNA。如果进行二次洗脱,总RNA的量会增加,但是浓度会降低,因为80%以上的RNA会在第一次时被回收。在加柱子前将水加热到65℃并室温孵育柱子5min会增加产量。
TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。
TRIZOL是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂,在样品裂解或匀浆过程中,TRIZOL 能保持RNA完整性。加入氯仿后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相,用异丙醇可沉淀回收RNA。
※0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。
※异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。
※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
TRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂,可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIZOL在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。
基本特点
Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA,该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质,可以通过分层分别将不同层中的RNA(上层)、DNA(中层)、蛋白质(下层)分离纯化出来,效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如,从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带,(mRNA和hnRNA成分)两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA,5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8
TRIZOL
http://baike.baidu.com/view/533842.htm
氯仿萃取RNA
异丙醇沉淀RNA
酒精清洗
RNA提取对于科研人员来说并不陌生,但是要得到好的结果却不是一件很容易的事情。事实上,现在市面上的丰富的RNA提取试剂基本上可以满足科研人员的需要,为什么往往提取的RNA却容易失败呢?
RNA提取失败的主要现象有三个:提取的RNA降解、提取的RNA量偏低以及提取的RNA纯度低。究竟怎样才能确保RNA提取的成功率呢?
首先,要确定材料的可用性。尽管现有的RNA提取试剂都用抑制RNase的成分,但提取的材料仍需谨慎处理。提取的材料的新鲜度是获取完整RNA的关键,但是由于种种原因无法立即从新鲜材料中提取RNA时,使用Takara公司的样品保护剂SampleProtectorforRNA/DNA可以免去使用液氮或超低温冰箱的不便,同时也可以有效解决组织、细胞样品的短时间保存及运输问题。此外,如果将不同时期收集的样品都预先存放于本试剂中,可以做到立即终止并固定RNA表达的时序变化,减少实验组间的误差。
其次,选择合适的提取试剂是最重要的一步。好的提取试剂在确保成功的同时,操作方便且经济实用。对于动物组织、简单的植物材料、各种微生物、培养细胞的totalRNA提取,Takara公司的RNAisoPlus具有诸多的成功案例。随着2013年7月柱型提取试剂TaKaRaMiniBESTUniversalTotalRNAExtractionKit的成功上市,进一步丰富了TakaraRNA提取的产品线。该产品采用了独特的细胞裂解系统,无需苯酚氯仿抽提等步骤,简单快捷。组织或细胞裂解后,提取操作仅需20分钟便可完成。
对于富含多糖多酚的植物类组织提取是个难点,Takara精心研发的柱型提取试剂TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit可以轻松解决这个问题。TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit可以高效地从各种简单的植物组织材料(叶片、茎、幼苗等)、富含多糖多酚的植物组织材料(果实、种子等)、真菌提取高纯度的TotalRNA,适用范围广泛。按照标准流程,本试剂盒可以有效地提取分子量大于200nt的RNA,也可以按照可选步骤提取得到包含SmallRNA(<200nt)的TotalRNA。试剂盒中包含了RNA提取所需的全部试剂,无需额外购买其它试剂。
--本来,看好丹麦Exiqon公司,Qiagen的两个试剂盒,无奈经费有限,这两个盒子很不错,价格也不菲,有米的兄弟姐妹可以买。
--另外查询到国产上海诺伦公司的血液(血清/血浆)总RNA抽提试剂盒--广州这边用的人不多,不知道上海那边的兄弟姐妹有什么经验?
---还有,北京康为世纪公司的游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂,货号:CW2281,也比较便宜,但是俺心中也没有底,请大家给点意见。
---已经订购了LIFETECHNOLOGY的TrizolLS专门提取体液RNA的试剂(100毫升2000元人民币,也不菲),准备预试验看看提取RNA的质量。(Lifetechnology公司的AM1556也不错,但是也不便宜,每个盒子40次/2590元)
----但是还是希望有试剂盒,比较简单,快捷,最重要的是样本量太大,要分离400份左右的血清。
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