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Gemini/Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Solution 30%/100mL-700-110
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二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术如今大行其道,各科研单位和检测服务公司都相继引入二代测序系统。然而,二代测序过程烦琐精密,其中对样本核酸量的准确定量是成败关键之一。现今在 NGS 过领域中,荧光核酸定量检测为业界比较认可和普及的方法。在法方上,常见的是 Life Technologies 公司的 Qubit 仪器配上其荧光探针。可是此方案每次检测单个样本,未必可轻松应付高通量样本。再者,对于珍... 查看更多>
Illumina高通量桌上型二代测序系统是由北京安麦格贸易有限公司代理或销售的Illumina品牌的仪器,产品来源于美国。北京安麦格贸易有限公司是中国最权威的Illumina高通量桌上型二代测序系统销售服务商之一,在北京等地方销售Illumina高通量桌上型二代测序系统已经多年。同时,生物在线为您提供众多企业Illumina高通量桌上型二代测序系统仪器产品及图片,以便挑选到性价比高,合适的Illumina高通量桌上型二代测序系统产品 查看更多>
默瑞生物创立以来,已经陆续导入TwistDx,enzymatics,KAPA BIOSYSTEMS,BioDynami,Jackson,Echelon,ChromoTek,Nanocs,Biotechrabbit,Lee Biosolutions, magtivio等优质国际品牌... 查看更多>
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本次CSCO国际白血病淋巴瘤专场迎来重磅嘉宾,哈佛大学医学院Munshi教授做了关于多发性骨髓瘤的MRD检测的报告,提到了利用免疫组二代测序提高MRD检测灵敏度是极为重要的。以更高的检测深度(如10-5,10-6)来作为MRD阳性的cut off可以有效的延长肿瘤病人的无进展生存期,帮助提高病人生活质量。微小残留病 (Minimal Residual Disease, MRD) 是指白血病/淋巴瘤/骨髓瘤患者经治疗缓解后,体内仍残留少量... 查看更多>
21世纪初期,二代测序(NGS)成为应用日益广泛的商业化技术。在十几年的时间里,数据的大量生成为分子生物学领域带来了巨大的进步。从1964年首个被测序的tRNA分子到如今人类基因组测序的实现,科技以极快的速度在发展。与此同时,引发了对高纯度、高质量的相关产品的需求,如寡核苷酸(oligonucleotides)的合成。 在文库构建过程中由于DNA接头(barcodes)的使用而造就的二代测序的多重分析能力(multiplexing ab... 查看更多>
在过去的十年,DNA测序比过去具有更快的速度和更低的价格,这一进步主要因为二代测序技术(NGS)的发展。二代测序技术现在被广泛应用于临床实践,包括实体瘤分析、血液肿瘤分析、遗传病分析和传染病分析;无创产前检测(NIPT);植入前诊断(PGD)和筛查(PGS)。 鉴于这一快速发展的领域,2014年2月中国食品药品监督局(CFDA)和国家卫生与计划生育委员会(NHFPC)暂停了临床二代测序检测,随后颁布了一系列二代测序检测监管要求。 CF 查看更多>
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SNaPshot技术是美国应用生物公司(ABI)开发,是一种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,也称小测序,主要针对中等通量的SNP分型项目。... 查看更多>
NextSeq500高通量二代测序系统是由北京安麦格贸易有限公司代理或销售的Illumina品牌的仪器,产品来源于美国。北京安麦格贸易有限公司是中国最权威的NextSeq500高通量二代测序系统销售服务商之一,在北京等地方销售NextSeq500高通量二代测序系统已经多年。同时,生物在线为您提供众多企业NextSeq500高通量二代测序系统仪器产品及图片,以便挑选到性价比高,合适的NextSeq500高通量二代测序系统产品 查看更多>
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用takara的in-fusion方法做了个重组质粒,如左图PCR验证,右起第二道是空载质粒为模板的对照。右图是酶切验证,两个图片结合起来觉得除了第四个单克隆外,其他几个应该都可能是阳性克隆。结果送了1,2两个样品后测序的结果都不对。为什么会这样。

1.TaqMan探针法 针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时,该探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来,破坏两荧光分子间的PRET,发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。
2.SNaPshot法 该技术由美国应用生物公司(ABI)开发,是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,也称小测序,主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中,引物延伸一个碱基即终止,经ABI测序仪检测后,根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点,根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析。

我的目的蛋白D2,是膜表达蛋白,构建了三种载体的重组质粒,分别为CMV,pCDNA3.1,pEGFP-N1,三个重组质粒酶切正确、测序正确,也曾表达过,可以砸出相应大小的目的条带。大提过后,有近一个半月没有进行转染表达,突然发现我的质粒不能砸出目的条带了,甚至外源性的anti-Flag都砸不到(pEGFP重组质粒转染可以观察到微弱荧光,比以前较少),已经重修小提过,也重新进行了酶切,进行测序,都没有问题,现在就是砸不到条带(阳性对照的Flag每次都可以),请各位大神帮忙!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

PCR程延伸阶段温度升72摄氏度左右高温度所溶液四种脱氧核苷酸需要耐高温Taq DNA聚合酶作用据碱基互补配原则合新DNA链

两个基因大小分别230kb和450kb,酶切后,450kb的有目的条带,但很弱,230kb的质粒条带亮,其下方有一很微弱条带,用的酶分别是:Ncol和Spel体系是(Takara,两个酶切体系不同,用的官网推荐体系):

NcoI1μl

Spel1μl

10×KBuffer2μl
0.1%BSA2μl
DNA3ul
灭菌水upto20μl37℃4h电泳1h

片段长度143bp,酶切位点kpn1和Hind3,连入pGL3b载体,测序引物公司用的pGL3-,第一次反向测序不成功,原因是质粒出现重叠峰,正向加测后成功,对比发现下游引物的酶切位点(Hind3)少了一个碱基(aagtcc变成aagct),重组质粒酶切切不出插入片段;之后将测序成功的质粒重新转化DH5α,再提质粒酶切还是切不出来。质粒小提试剂盒Qiagen的,提取菌液1.5mL,浓度608.2ng/uL,酶切质粒2ug。
【之前构建的4个重组质粒里也有两个出现这样的问题(aagtcc变成agtcc),但是酶切能切出插入的片段】
目前问测序公司得到的答复是样品可能不是单克隆,测序结果是不准确的,建议重新挑取单克隆测序。
不知道还有没有别的方法?
1.TaqMan探针法 针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时,该探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来,破坏两荧光分子间的PRET,发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。
2.SNaPshot法 该技术由美国应用生物公司(ABI)开发,是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,也称小测序,主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中,引物延伸一个碱基即终止,经ABI测序仪检测后,根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点,根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析。
3.HRM法 高分辨率熔解曲线分析(HRM)是近几年兴起的SNP研究工具,它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况,来判断是否存在SNP,而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形,因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限,无需序列特异性探针,在PCR结束后直接运行高分辨率熔解,即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针,操作简便、快速,成本低,结果准确,并且实现了真正的闭管操作。
4.Mass Array法 MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具,通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDI-TOF-MS技术相结合,实现基因分型检测。基于MassARRAY平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高达40重的PCR反应和基因型检测,实验设计灵活,分型结果准确性高。根据应用需要,对数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时,MassARRAY具有最佳的性价比,特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证,或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。
5.Illumina BeadXpress法 采用Illumina公司的BeadXpress系统进行批量SNP位点检测,可以同时检测1-384个SNP位点,往往用于基因组芯片结果确认,适合高通量检测。微珠芯片具有高密度、高重复性、高灵敏度、低上样量、定制灵活等特点,极高的集成密度,从而获得极高的检测筛选速度,在高通量筛选时可显著降低成本。向左转|向右转
DNAsanger测序法原理.pdf123
专心学生物2017-10-02
为甚么只有加法系统不行?最好举例说明,谢谢!!!
蛋白质的酶水解过程研究123
℡欠诚灬2017-10-03
●目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶(proteolytic enzyme)或称蛋白酶(proteinase)已有十多种。
●应用酶水解多肽不会破坏氨基酸,也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。向左转|向右转

1、目的基因与质粒载体(pET21b)双酶切连接,转DH5a感受态细胞,挑取单菌落,菌落PCR可以P出目的条带(引物是pET21b载体上设计的),扩大培养,提取质粒,但是双酶切只有一条带,测序显示目的基因已连在载体上,双酶切了很多次,都切不出来目的条带,也不是酶切体系(20-100ul都尝试过)和酶切时间(3-4h,过夜都试过)的问题。

求高手指点,到底哪里出问题了!!!

我在做基因敲除实验(CRISPR/Cas9),实验室一直都是直接送测序验证的,又看到资料说,有用T7E1酶的,也有用SURVEYOR的。
不是很相信网上的商家,遂求助各位路过的大虾们,有用过的吗?这些酶特异性怎样啊?贵不贵,跟我直接测序相比,有优势吗?
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