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제품특징
□ 특징
● Streamlined method : genome editing 이후, 다양한 Indel sequence 확인
● CRISPR/Cas9 뿐만 아니라 TALENs, ZFNs 이후 Indel identification에사용 가능
● Ultrafast protocol : Cell direct PCR과 In-Fusion Cloning을 조합한 빠른 프로토콜
● Complete kit : target 의 증폭, 복제, sequencing용 샘플 제작에 필요한 모든 시약 포함
□ 제품설명
Guide-it IndelIdentification Kit는 genome editing (CRISPR/Cas9,TALENs, ZFNs) 이후 얻어진Indel (Insertions and deletions)의다양성을 확인하는 데 최적화된 제품이다. 본 제품은 DNA 서열분석을 위한 target site의 amplify, clone,sequencing용 샘플 조제를 위한 모든 제품과 프로토콜을 구비하고 있어 신속하고 신뢰성 높은 결과를 얻을 수 있다. Terra PCR Direct polymerase를 사용하므로 DNA 추출, 정제 없이 crude cell lysate로부터 genomic DNA fragment를 증폭할 수 있으며, 증폭산물은 In-Fusion Cloning 방법을 이용하여 pre-linearizedpUC19에 바로 cloning 할 수 있다. 이후제품 내에 포함된 Stellar Competent Cell에transformation 이후 생성된 Colony는colony PCR 하여 target region을 증폭한 후 시퀀싱하여 Indel 서열을 분석할 수 있다 (그림 1, 그림 2).
그림1. The Guide-it Indel Identification Kit provides a complete workflow foridentifying the variety of insertions and deletions (indels) introduced bynuclease-based genome editing. The protocol uses direct PCR to amplify a genomic DNA fragment (~500 to 700 bp) containing thetarget site directly from crude cell lysates (step 1). The resulting amplifiedfragments contain a pool of edited target sites from individual cells. ThesePCR products are cloned directly into a pre-linearized pUC19 vector using theIn-Fusion cloning system (step 2).After transformation of an optimized E.coli strain, colony PCR is used to amplify the target site from the plasmid(step 3). DNA sequencing is then used to identify the different indelsgenerated at the targeted genomic site (step 4).
그림2. Identification of insertions and deletions (indels) in the CD81 gene afterCRISPR/Cas9 targeting. HeLa cells were transfectedwith plasmids encoding Cas9 and an sgRNA targeting the CD81 gene. The Guide-itIndel Identification Kit was used to prepare CD81 target sites for DNA sequenceanalysis. The sequencing data from six clones was aligned with the wild-typesequence, revealing a broad range of indels in the CD81 gene.
□ 적용
● Detecting insertions and deletions introduced in mammalian genomic DNA
● Characterizing the variety of indels that are present in a cell population after nuclease-based gene editing
□ 구성품
● Guide-it Indel Identification Components
● 110μl Terra PCR Direct Polymerase Mix
● 3x 1 ml 2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP)
● 400μl Extraction Buffer 1
● 40 μl ExtractionBuffer 2
● 10 μl pUC19Cloning Vector, linearized (50 ng/μl)
● 200 μl ColonyPCR Forward Primer (15 μM)
● 200 μl ColonyPCR Reverse Primer (15 μM)
● 6x 1 ml PCR-Grade Water
● In-Fusion HD Cloning Kit
● NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit
● Stellar Competent Cells
□ 보존
Guide-it Indel Identification | -20℃ |
In-Fusion HD Cloning Kit | -20℃ |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | 실온 |
Stellar Competent Cells:-70℃ | -70℃ |
그 외 구성품 | -20℃ |
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原理?(没有就算了...)
答的好的提高悬赏50分
有原理的追加50分
谢谢啊~~~~
为适应医疗器械监督管理工作的需要，总局组织有关单位和专家对恒温核酸扩增检测仪等22个产品的管理类别进行了界定。现通知如下：
一、作为Ⅲ类医疗器械管理的产品（1个）
恒温核酸扩增检测仪：由检测系统、加热模块、温控系统、触摸屏和随机软件组成。基于荧光检测的恒温核酸扩增检测技术，定性检测样本中的目标核酸有无扩增。分类编码：6840。
二、作为Ⅱ类医疗器械管理的产品（7个）
（一）免疫磁微粒捕获仪：由蠕动泵、管路、永磁铁及其他必要辅助器具组成。用于磁微粒免疫分析中捕获磁微粒复合物，是临床免疫磁微粒检验分析的前处理设备。分类编码：6841。
（二）精液采集器：由精液收集套、润滑剂、精液采集管、采集漏斗、袖珍剪组成。产品以无菌型式提供。临床上用于收集成年男性精液，为评价男性生育能力提供完整标本。分类编码：6841。
（三）干式血细胞微量样品测试管：由测试管体、封管器、浮子、肝素钠抗凝剂和荧光吖啶橙染料组成。用于收集末梢血样和静脉血样，临床上与干式血细胞计数仪配合使用，对样本染色、抗凝和分类。分类编码：6841。
（四）胎盘生长因子检测试剂盒（时间分辨荧光法）：由校准品、铕标示踪抗体、分析缓冲液、生物素抗体、链霉亲和素微孔板条、条形码标签等组成。用于定量测定孕妇血清中的胎盘生长因子。临床上用于辅助筛查妊娠妇女孕早期唐氏综合症风险。分类编码：6840。
（五）脂联素检测试剂盒（免疫比浊法）：由试剂1（缓冲液）和试剂2（乳胶抗体试剂）组成。用于体外定量检测人血清或血浆中脂联素浓度。临床上用于评估2型糖尿病和心血管疾病的风险。分类编码：6840。
（六）小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒（直接清除法）：由试剂（含过氧化氢酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脂酶、显色剂的缓冲液）和试剂（含过氧化物酶、酶稳定剂、显色剂的缓冲液）组成。用于体外定量检测人血清中小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量，临床上用于动脉粥样硬化的辅助诊断。分类编码：6840。
（七）尿液游离LamBDa-轻链测定试剂盒（免疫比浊法）：由定标液、试剂缓冲液和试剂（游离Lambda-轻链抗血清）组成。用于体外定量测定尿液游离Lambda-轻链浓度，临床上用于单克隆丙种球蛋白增多症的辅助诊断。分类编码：6840。
三、作为第Ⅰ类医疗器械管理的产品（13个）
（一）制片染色一体机：通常由离心模块、制片模块、染色模块、控制系统等功能模块组成。用于病理分析前对人体细胞或细菌样本进行制片及染色。分类编码：6841。
（二）细胞分离制片染色一体机：通常由控制系统、过滤器、多路阀注射泵、贮液瓶、废液瓶等组成。适用于病理分析前对人体外周血或组织样本中细胞的分离、过滤、制片和染色。分类编码：6841。
（三）试剂卡孵育器：由塑料外壳、温控模块、电器元件组成。用于特定试剂卡的孵育。分类编码：6840。
（四）细胞过滤采集器：由软管、过滤收集病变细胞装置、抽吸装置组成。用于病理分析前对人体内脱落病变细胞的采集。分类编码：6841。
（五）液基细胞和微生物处理、保存试剂：主要由细胞保存液、细胞裂解液、提取液、稀释液、消化酶、防腐剂等及必要的细胞承载或制片器具组成。用于临床检验分析前细胞或微生物的保存、运输、提取、分离、沉淀、固定、制片等。分类编码：6840。
（六）病理分析前处理试剂：主要由组织固定液、组织脱水液、透明液、清洗剂等组成。用于病理分析前组织标本的固定、梯度脱水、透明、浸蜡和包埋制片。分类编码：6840。
（七）脱蜡液：由脱蜡液、防腐液、专用水等组成。用于对样本进行染色前预处理，去除石蜡包埋组织样本上的石蜡。分类编码：6840。
（八）触发缓冲液：由0.9％的氯化钠等渗溶液组成。与血小板功能分析仪及配套检测试剂盒配套使用，用于在检测前润湿生化活性膜。分类编码：6840。
（九）流式细胞分析用鞘液：由含盐缓冲液和防腐剂组成。用于与流式技术相关的分析中对样本进行检测时形成鞘流，以利于仪器进行计数分析。分类编码：6840。
（十）流式细胞分析用溶血剂：由浓度小于2％的甲醛和浓度小于15％的甘油组成。用于快速裂解人类外周血中红细胞，维持白细胞基本形态，临床上用于流式细胞仪检测前样本处理。分类编码：6840。
（十一）抗体稀释液：由缓冲液和防腐剂组成。用于临床检验时抗血清的稀释。分类编码：6840。
（十二）溶痰剂：由次氯酸钠、表面活性剂组成。用于抗酸染色前痰标本的均质化处理，以提高阳性检出率。分类编码：6840。
（十三）精液液化剂：由菠萝蛋白酶和蔗糖组成。用于精液检查前促进液化迟缓的精液标本的液化、降低精液的粘稠度。分类编码：6840。
四、不按照医疗器械管理的产品（1个）
瓷珠菌种保存管：由表面多孔的小瓷珠、胰蛋白脉大豆肉汤、甘油和蔗糖按一定比例混合组成。用于微生物检验中菌种的保存。
自本文件发布之日起，对于不作为医疗器械管理的，如已受理尚未完成注册审批的，食品药品监管部门应按规定不予注册，相关注册申请资料予以存档。尚在有效期内的医疗器械注册证书不得继续使用。
食品药品监管总局办公厅
2015年6月11日
核酸扩增是核酸分子诊断的关键技术。根据核酸扩增反应中温度变化要求，可以将核酸扩增技术分为两大类：一类是PCR核酸扩增技术，另一类是核酸恒温扩增技术。
PCR技术是指通过控制温度的变化来实现DNA扩增的三个步骤：模板变性（如95℃）－引物杂交（如58℃）－DNA合成（如72℃）。这种温度变化的循环重复（如重复35次）过程通常由精密而复杂的仪器（PCR仪）来控制。核酸恒温扩增技术（NucleicAcidIsothermalAmplification，NAIA）则是扩增反应的全过程均在同一温度下进行，不须象PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程。这一特点使得它们对扩增所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，因而具有巨大的应用价值，成为分子诊断行业发展中的热点。
目前的NAIA技术主要有滚环扩增技术（RollingCircleAmplification，RCA）、转录酶扩增技术(TranscriptionMediatedAmplification，TMA)、依赖核酸序列扩增技术(NucleicAcidSequenceBasedAmplification，NASBA)、链置换扩增技术(stranddisplacementamplification，SDA)、环介导的等温扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP）、解链酶扩增技术（HelicaseDependentAmplification，HDA）。上述各种核酸扩增技术均由国外公司所拥有。
交叉引物扩增技术（CrossingPrimingAmplification，CPA）是完全由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。CPA与优思达公司其他技术相结合(如快速核酸提取技术、核酸试纸条检测技术等)，形成一个完整的现场快速分子检测平台，可以开发出众多恒温扩增检测试剂盒，广泛应用于分子诊断、防疫检疫、生物医学研究、个体化治疗等领域。该技术已申请中国和美国发明专利，在美国《MolecularDiagnostics》等杂志发表论文二篇，并通过了比尔?盖茨基金会资助申请。
CPA扩增体系中除包含具有链置换功能的BstDNA聚合酶外，还主要包括扩增引物和两条交叉引物。这些寡聚核苷酸链能依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使DNA的循环扩增能不断的实现。CPA扩增主要包含以下几个步骤：
交叉正向引物CPF中的PFs与模板DNA中PFa互补，启动DNA合成，使得PRa被引入到所扩增的产物中;
外围引物DP1s与PFa前端DP1a序列互补，通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，一边置换CPF合成的能与CPR和DP2a结合的单链产物（结构3），一边与模板DNA形成双链产物（结构2）;
在结构3中，DP2a通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，置换出由CPR所延伸的单链产物（结构5），同时合成与步骤2中由CPF延伸所产生单链DNA形成双链产物（结构4）,而结构5相对起始的DNA模板，多了PRs和PFs两个片段序列;
单链结构5中的3’端的PFa和PRs可分别与CPF中的PFs和CPR中的PRa互补结合，可在链置换型DNA聚合酶的作用下延伸和置换出相应的单链产物。延伸产物相对结构5来说又增加了一个PFs区域（结构8）;
因此，扩增引物CPF和CPR的不断杂交和延伸，不仅使得结构5的长度不断的加长,从而引入更多CPF和CPR3’端互补区域，同时也置换出了各种可与CPF和CPR3’端互补的单链产物;
通过CPF和CPR的不断杂交延伸和DNA聚合酶的链置换作用，使得DNA拷贝数不断的增加，从而达到基因扩增的效果。
使用本装置提取临床生物样品的核酸成本低廉，只需几分钟，可以应用于现场检测或实验资源较少的基层医院和经济不发达地区；同时也可以满足大医院特定情况下的需求，如急诊或床边的核酸快速诊断。该技术已申请发明专利，并取得盖茨基金会研发资助。
CPA基本原理如下：
图2CPA扩增的反应原理图
与目前广泛使用的荧光PCR技术相比较，CPA技术有以下几个优点：
反应速度快：反应时间约1小时，使试剂盒可用于检验检疫、突发性传染病的检测与监控现场检测或医院的床边诊断（Point-of-Testing,POCT）；
检测成本低：目前荧光光定量PCR仪价格昂贵，无法在很多中小医院普及。CPA扩增只需要离心机和一台简单的恒温装置，如普通的水浴锅、金属浴，即可进行扩增。
操作简单：对操作人员的技能要求不高，绝大多数人通过简单培训或自学都可掌握，为核酸检测试剂的广泛应用创造了条件。
1．目的
学会PCR操作的基本技术。
2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。
4．试剂
5U/μlTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。
5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：Senseprimer5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇
Antisenseprimer５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇
目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶（chitinase，CHI）基因。
待扩增的CHI片段长度：996bp。
6．操作步骤
（1）在0.2mlPCR微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
ddH2O32μl
10×PCRbuffer（不含MgCl2）5μl
25mMMgCl23μl
2.5mmol/LdNTP4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/LPrimer12μl（12.5~25pmoles）
10μmol/Lprimer22μl（12.5~25pmoles）
模板质粒1μl（1×10-3pmoles）
5U/μlTaq酶1μl（5U）
总体积50μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
①94℃5min
②94℃1min
③54℃1min
④72℃1min50s
⑤goto②29times
⑥72℃10min
（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。
7．思考
（1）复性温度如何确定？
（2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？
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