class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesPhospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAbRecombinant：卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造。\">RRecombinant ×什么是重组抗体，为什么它很重要？

与传统抗体相比，重组抗体具有几个关键优势。这些优势包括批次间一致性、连续供应和无动物制造。因此，重组抗体越来越多地用于科学研究，特别是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。

什么是重组抗体？

传统的多克隆抗体和单克隆抗体是正常B细胞​​发育和基因重组的产物国家。它们是通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生的。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统容易发生遗传漂移，并且在稳定性，增加批次间差异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。当多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化时，重组抗体则从组织培养上清液中纯化转染的宿主细胞系。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，都必须在实验使用前在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb#9018Reviews ()引用 (173)Filter:WBIPIFF对 LNCaP 细胞提取物进行蛋白质印迹分析，该细胞转染表达 Akt1 shRNA 或 Akt2 shRNA 的构建体，未诱导 (-) 或多西环素诱导对于指定时间，使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（顶部）、Phospho-Akt2 (Ser474) (D3H2) Rabbit mAb #8599（从顶部第二个）、Akt1 (C73H10) Rabbit mAb #2938 （中）、Akt2 (D6G4) 兔单克隆抗体 #3063（下数第二个）或 PI3 激酶 p85 (19H8) 兔单克隆抗体 #4257（下）。 （数据由马萨诸塞州波士顿贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院的 Rebecca Chin 博士和 Alex Toker 博士友情提供）。显示更少显示更多 对纯化的重组磷酸化 Akt1 进行蛋白质印迹分析、磷酸化 Akt2 和磷酸化 Akt3 蛋白，使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（上图）、Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（中图）和 Akt（平底图） (C67E7) 兔单克隆抗体 #4691（下）。显示更少显示更多 Akt1 (-/-) 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 提取物的蛋白质印迹分析或Akt2 (-/-) MEF，未经处理或用 hPDGF #8913（100 ng/ml，15 分钟）刺激，使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（上）、Phospho-Akt (Ser473) ( D9E) XP® Rabbit mAb #4060（中）或 Akt（泛）(C67E7) Rabbit mAb #4691（下）。显示更少显示更多 Akt1 (-/-) 小鼠的共聚焦免疫荧光分析胚胎成纤维细胞 (MEF)（左栏）或 Akt2 (-/-) MEF（右栏）细胞，用 hPDGF #8913（100 ng/ml，15 分钟）刺激（顶部 row) 或使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（绿色）用 LY294002 #9901（底行）抑制。肌动蛋白丝用 DY-554 鬼笔环肽（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。显示更少显示更多 对未经处理（绿色）或经 LY294002 #9901、Wortmannin #9951 和 U0126 处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析#9903（50 μM、1 μM 和 10 μM，2 小时；蓝色）使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（虚线）。 Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。显示更少显示更多图片库详细了解我们如何获取图像 × Phospho-Akt1 ( Ser473) (D7F10) XP® 兔单克隆抗体 9018 Toggle BetweenDark and Light ModesFilter:WBIPIFF 使用 Phospho-Akt1 对 LNCaP 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析，该细胞转染表达 Akt1 shRNA 或 Akt2 shRNA 的构建体，未诱导 (-) 或多西环素诱导指定时间(Ser473) (D7F10) XP® 兔单克隆抗体（上）、Phospho-Akt2 (Ser474) (D3H2) 兔单克隆抗体 #8599（从上数第二个）、Akt1 (C73H10) 兔单克隆抗体 #2938（中）、Akt2 (D6G4) 兔mAb #3063（从底部数第 2 个）或 PI3 激酶 p85 (19H8) 兔单克隆抗体 #4257（底部）。 （数据由马萨诸塞州波士顿贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院的 Rebecca Chin 博士和 Alex Toker 博士友情提供）。 使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（上）、Phospho-Akt 对纯化的重组磷酸化 Akt1、磷酸化 Akt2 和磷酸化 Akt3 蛋白进行蛋白质印迹分析(Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（中）和 Akt（泛）(C67E7) Rabbit mAb #4691（下）。Akt1 (-/-) 小鼠提取物的蛋白质印迹分析胚胎成纤维细胞 (MEF) 或 Akt2 (-/-) MEF，未经处理或用 hPDGF #8913（100 ng/ml，15 分钟）刺激，使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（上），Phospho -Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（中）或 Akt（pan）(C67E7) Rabbit mAb #4691（下）。对使用 hPDGF #8913 (100 ng/ml，15 分钟）（顶行）或使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（绿色）用 LY294002 #9901（底行）抑制。肌动蛋白丝用 DY-554 鬼笔环肽标记（红色）。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。对未经处理（绿色）或经 LY294002 #9901、Wortmannin #9951 和 U0126 #9903 (50) 处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析μM、1 μM 和 10 μM，2 小时；蓝色）使用 Phospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（虚线）线). 抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 片段 (AlexaFluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。购买 #9018Cat。 #SizeQty.Price9018T20µl$1639018S100µl$407

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抗体保证FAQTech Support-- Datasheet --Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your RegionAmerica-EnglishChina-ChineseChina-EnglishEurope-DutchEurope-EnglishEurope-FrenchEurope-GermanEurope-ItalianEurope-PortugueseEurope-SpanishEurope-SwedishKorea-EnglishKorea-KoreanCertificate of AnalysisSupporting DataRelated产品产品使用方案背景途径引文和评论支持数据反应性H M RSENSITIVITY内源性MW (kDa)60Source/IsotypeRabbitIgGApplication Key:WB-Western BlotIP-ImmunoprecipitationIHC-免疫组织化学Chromatin-Chropiticationc＆r-Cut＆r-Cut＆t-cut＆t-cut＆tagdb-dot bloteclipif-immunofluorescencef-immunofluorescencef-flow-flow cytometryspecies交叉反应密钥： melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S。酿酒酵母 Ce-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species Expected相关产品

产品信息

产品使用信息ApplicationDilutionWestern Blotting1:1000免疫沉淀1:50免疫荧光（免疫细胞化学）1:200 - 1:800流式细胞术（固定/透化） )1:200 - 1:800 在 10 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和少于 0.02% 的叠氮化钠中提供。储存于 –20°C。不要等分抗体。方案选择您的方案Western Blotting免疫沉淀免疫荧光（免疫细胞化学）流式细胞术（固定/透化）PRINT

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中在 4°C 下轻轻摇动孵育过夜。

注意：请参阅推荐抗体稀释度的一抗产品网页。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ ... (#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合。1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过添加准备新鲜的 3X 还原上样缓冲液1/10 体积的 30X DTT 到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。用 dH2O.10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液稀释至 1X：(#4050) 准备关于 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇中 + 700 ml dH2O，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：(#9999)。封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 ％牛血清白蛋白；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议使用 0.2 µm 的孔径。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG、HRP-linked Antibody (#7074).检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883).B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。置于冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质阶梯 (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量。

电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜阻断和蚂蚁ibody 孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选） 转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。二。一抗孵育将膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将膜与 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（#7074，1:2000）和抗生物素、HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000）一起孵育，以检测 10 ml 中的生物素化蛋白质标记物在室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测n（D 部分）.D.蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，用于 10毫升，加入 5 毫升试剂 A 和 5 毫升试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：10

天然蛋白质的免疫沉淀

本方案是旨在对天然蛋白质进行免疫沉淀，以便通过蛋白质免疫印迹或利用蛋白质 A 磁分离进行激酶活性分析。

A.溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，添加 50 ml 20XPBS 加入 950 ml dH2O，混合。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O，混合。

注意：在使用前立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3X SDS 样品缓冲液：蓝色加载包 (#7722) 或红色加载包 (#7723) 通过添加 1/10 制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液体积 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。蛋白 A 磁珠：(#73778)。磁性分离架：(#7017) 或 (#14654)。10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）：(#9802)准备 1 ml 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加到 900 µl dH2O 中，混合 ATP (10 mM)（用于激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml ATP (200 µM)，添加 10 µl ATP (10 mM) 至 490 µl 1X 激酶缓冲液。B.准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加含有调节剂的新鲜培养基达到所需时间来处理细胞。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解液加入每个板 (10 cm) 并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移至微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声处理 3 次，每次 5 秒。在 4°C 下以 14,000 x g 微量离心 10 分钟，并将上清液转移到新管中。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预澄清（可选）

强烈推荐细胞裂解物预澄清步骤，以减少非特异性蛋白质与 Protein A 磁珠的结合。预澄清足够的裂解物用于测试样品和同种型对照。

短暂涡旋储备管以重悬磁珠。

重要：使用前预洗 #73778 磁珠：

转移 20微升珠浆到干净的管中。将试管置于磁力分离架上 10-15 秒。

溶液澄清后小心取出缓冲液。向磁珠沉淀中加入 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液，短暂涡旋以清洗磁珠DS。将管放回磁力分离架。解决方案澄清后取出缓冲液。再次重复洗涤步骤。

将 200 μl 细胞裂解物添加到 20 μl 预洗磁珠中。

重要提示：最佳裂解物浓度将取决于目标蛋白质的表达水平。建议起始浓度在 250 μg/ml-1.0 mg/ml 之间。

在室温下旋转孵育 20 分钟。使用磁力分离架将珠子与裂解物分离，将预澄清的裂解物转移到清洁试管，并丢弃磁珠沉淀。继续进行免疫沉淀部分。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。兔多克隆一抗使用 Normal Rabbit IgG #2729，兔单克隆一抗使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，小鼠 (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415单克隆 IgG1 一抗，Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆 IgG2b 一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

将一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜。形成免疫复合物。预洗磁珠（参见细胞裂解物预清除部分，步骤 1 和 2）。将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到含有预洗磁珠沉淀的试管中。旋转孵育室温 20 分钟。使用磁力分离架沉淀珠子。用 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次洗涤之间保持在冰上。继续进行通过蛋白质免疫印迹或激酶活性分析（D 部分）。样品分析

继续执行以下一组特定步骤。

通过蛋白质免疫印迹分析用 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物，短暂涡旋混合，然后短暂微量离心以沉淀样品。将样品加热至 95-100°C，持续 5 分钟。使用磁力分离架沉淀珠粒。将上清液转移到新管中。上清液即为样品。通过蛋白质印迹法分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验步骤）。

注意：为尽量减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 引起的掩蔽，我们建议使用小鼠抗兔 IgG（轻链Specific) (D4W3E) mAb (#45262)​​ 或小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）。为尽量减少变性 IgG 轻链 (~25 kDa) 引起的掩蔽，我们建议使用小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）。

用于分析激酶酶ayWash 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 凝胶上。

2008 年 12 月发布

2021 年 4 月修订

方案 ID：410

免疫荧光（免疫细胞化学）A。溶液和试剂

使用我们的 #12727 免疫荧光应用解决方案套件中高效且经济的预制试剂获得更高质量的免疫荧光图像

注意：使用反渗透去离子 (RODI) 或等等级的水。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O，混匀。将 pH 值调节至 8.0。甲醛：16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.（目录号 18814），使用新鲜的并打开的小瓶在 4°C 避光条件下储存，在 1X PBS 中稀释以备使用。封闭缓冲液（1X PBS / 5 % 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O，混合均匀。搅拌的同时，加入 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液（1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100）：要制备 10 ml，将 30 µl Triton™ X-100 添加到 10 ml 1X PBS 中。混合均匀，然后加入 0.1 g BSA (9998)，混合。

推荐的荧光染料偶联的抗兔二抗：

抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor ® 488 偶联物）#4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4413Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor ® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961).B.标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

吸出液体，然后用在 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛覆盖细胞至 2–3 mm 的深度。

注意：甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

让细胞固定 15 分钟在室温下吸出固定剂，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。继续进行免疫染色（C 部分）。免疫染色

注意：除非另有说明，否则所有后续孵育均应在室温下进行，以防止干燥和荧光染料褪色。

在封闭缓冲液中封闭样本 60 分钟. 封闭时，按照产品网页上的说明在抗体稀释缓冲液中稀释以制备一抗。吸出封闭液，应用稀释的一抗。Incub在 4°C 下过夜。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。在抗体稀释缓冲液中稀释的荧光染料偶联二抗中孵育标本，室温避光孵育 1–2 小时。在 1X PBS 中冲洗 3 次，用于每个 5 分钟。用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) 盖玻片。为获得最佳效果，让封固剂在室温下固化过夜。对于长期储存，请将载玻片平放于 4°C 避光保存。

2006 年 11 月发布

2013 年 11 月修订

方案 ID： 24

流式细胞术，兔抗体 A 的甲醇透化协议。溶液和试剂

本方案所需的所有试剂都可以在我们的细胞内流式细胞术试剂盒（甲醇）#13593 中有效地一起购买，或者使用下面列出的目录号单独购买。

注意：使用反渗透制备溶液去离子水 (RODI) 或同等级别的水。

1X 磷酸盐e 缓冲盐水 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水混合物中。4% 甲醛，无甲醇 (#47746)100% 甲醇 (#13604)：冷却前使用抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或通过将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解在 100 ml 1X PBS 中来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。推荐的抗兔二抗::抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (PE Con​​jugate) #79408

注意：当您的实验中包含荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参阅染料产品页面以了解推荐的方案。访问 www.cellsignal.com 以获取经过验证可用于 fl 的细胞染料的完整列表流式细胞术。

B.固定

注意：贴壁细胞或组织应在固定前解离并置于单细胞悬液中。

注意：最佳离心条件将因细胞类型和试剂体积而异。通常，150-300g 1-5 分钟就足以沉淀细胞。

注意：如果使用全血，裂解红细胞并在固定前离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，则可以在固定前添加靶向 CD 标记或其他细胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，抗体将保持与目标靶标的结合。但是，请注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化之前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

通过离心沉淀细胞并去除上清液。在大约 100 µl 4% 甲醛溶液中重悬细胞即 100 万个细胞。充分混合以分离沉淀并防止单个细胞交联。在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。用过量的 1X PBS 离心洗涤。在适当的废物容器中丢弃上清液。在 0.5-1 ml 1X PBS 中重悬细胞。继续进行透化步骤。或者，细胞可以在 4°C 的 1X PBS.C 中储存过夜。通透化通过将冰冷的 100% 甲醇缓慢加入预冷的细胞中来通透细胞，同时轻轻涡旋，使甲醇的最终浓度达到 90%。在冰上通透化至少 10 分钟。继续进行免疫染色（D 部分）或储存细胞在 -20°C 的 90% 甲醇中。免疫染色

注意：使用血细胞计数器或替代方法对细胞进行计数。

将所需数量的细胞等分到试管或孔中。 （通常，每次测定 5x105 至 1x106 个细胞。）通过在过量的 1X PBS 中离心来洗涤细胞以去除甲醇。将上清液丢弃在适当的废液容器中。如有必要，请重复。重悬 ce加入 100 µl 稀释的一抗，在抗体稀释缓冲液中按推荐的稀释度或通过滴定法制备。在室温下孵育 1 小时。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 100 µl 稀释的荧光染料偶联二抗中重悬细胞（按推荐稀释度在抗体稀释缓冲液中制备）。在室温下孵育 30 分钟。避光。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞并在流式细胞仪上进行分析。

2009 年 7 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id : 404

Specificity/SensitivityPhospho-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® Rabbit mAb 仅在 Ser473 位点磷酸化时才能识别 Akt1 蛋白的内源水平。当 Ser474 位点磷酸化时，它不会检测 Akt2 蛋白。物种反应性：

H人类, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

单克隆抗体是通过使用与人 Akt1 蛋白 Ser473 周围残基相对应的合成磷酸肽对动物进行免疫接种而产生的。

背景

Akt，也称为PKB 或 Rac 在控制存活和细胞凋亡方面起着关键作用 (1-3)。这种蛋白激酶被胰岛素和各种生长和存活因子激活，在涉及 PI3 激酶的渥曼青霉素敏感通路中发挥作用 (2,3)。 Akt 通过磷脂结合和 PDK1 (4) 在 Thr308 处的激活环磷酸化以及通过在羧基末端在 Ser473 处的磷酸化来激活。之前难以捉摸的负责 Akt 在 Ser473 位点磷酸化的 PDK2 已被鉴定为雷帕霉素 (mTOR) 的哺乳动物靶标，与 rictor 和 Sin1 形成雷帕霉素不敏感复合物 (5,6)。 Akt 通过磷酸化和失活多个靶标（包括 Bad (7)、叉头转录因子）来抑制细胞凋亡，从而促进细胞存活(8)、c-Raf (9) 和 caspase-9。 PTEN 磷酸酶是 PI3K/Akt 信号通路的主要负调节因子 (10)。 LY294002 是一种特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。 Akt 的另一个重要功能是通过 GSK-3α 和 β 的磷酸化和失活来调节糖原合成 (12,13)​​。 Akt 也可能在葡萄糖转运的胰岛素刺激中发挥作用 (12)。除了在存活和糖原合成中的作用外，Akt 还通过阻止 GSK-3β 介导的细胞周期蛋白 D1 (14) 磷酸化和降解以及通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和p21 Waf1/Cip1 (16)。 Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感复合物中的 mTOR，在细胞生长中发挥关键作用 (17)。更重要的是，Akt 磷酸化和失活块蛋白 (TSC2)，一种 mTOR-raptor 复合体中的 mTOR 抑制剂 (18,19)。

Franke, T.F.等。 (1997) Cell 88, 435-7.Burgering, B.M.和Coffer, P.J. (1995) Nature 376, 599-602.Franke, T.F.等。 (1995) Cell 81, 727-36.Alessi, D.R.等。 (1996) EMBO J 15, 6541-51.Sarbassov, D.D.等。 (2005) Science 307, 1098-101.Jacinto, E. 等人。 (2006) Cell 127, 125-37.Cardone, M.H.等。 (1998) Science 282, 1318-21.Brunet, A. 等人。 (1999) Cell 96, 857-68.Zimmermann, S. 和 Moelling, K. (1999) Science 286, 1741-4.Cantley, L.C.和尼尔，B.G. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 4240-5.Vlahos, C.J. 等。 (1994) J Biol Chem 269, 5241-8.Hajduch, E. 等。 (2001) FEBS Lett 492, 199-203.Cross, D.A.等。 (1995) Nature 378, 785-9.Diehl, J.A.等。 (1998) Genes Dev 12, 3499-511.Gesbert, F. 等。 (2000) J Biol Chem 275, 39223-30.Zhou, B.P.等。 (2001) Nat Cell Biol 3, 245-52.Navé, B.T.等。 (1999) Biochem J 344 Pt 2, 427-31.Inoki, K. 等人。 (2002) Nat Cell Biol 4, 648-57.Manning, B.D.等。 (2002) Mol Cell 10, 151-62.Pathways

探索与该产品相关的通路。

选择您的通路AMPK SignalingAdherens Junction DynamicsA伊尔茨海默氏病血管生成细胞凋亡调节 B 细胞受体信号转导 ESC 多能性和分化ErbB/HER 信号转导G1/S 检查点IL6 信号转导抑制细胞凋亡微管动力学线粒体控制细胞凋亡NF-kB 信号转导PI3K/Akt 信号转导蛋白激酶 C 信号转导T 细胞受体转导信号TGF-ß 信号转导：eIF4E 和 p7 0S6KWarburg EffectmTOR信号×上游/下游蛋白质

STRING - 已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。

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UniProt ID：P31749

Entrez-Gene Id：207

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