MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法)一：概述microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程：二：背景资料检测人脑组织中miRNA的表达。所选的miRNA及其扩增长度信息如下：　  Primer ID  Mature_Acc  Mature_ID  PCR_SIZE1  hsmq-0031_01   MIMAT0000069   has-miR-16   752  hsmq-0032_01   MIMAT0000422   hsa-miR-124   733  hsmq-0033_01   MIMAT0000443   hsa-miR-125a-5p   774  hsmq-0034_01   MIMAT0000423   hsa-miR-125b   755  hsmq-0035_01   MIMAT0000429   hsa-miR-137   766  hsmq-0036_01   MIMAT0000250   hsa-miR-139-5p   757  hsmq-0037_01   MIMAT0000437   hsa-miR-145   768  hsmq-0038_01   MIMAT0000450   hsa-miR-149   769  hsmq-0039_01   MIMAT0000439   hsa-miR-153   7510  hsmq-0040_01   MIMAT0000452   hsa-miR-154   7511  hsmq-0041_01   MIMAT0000259   hsa-miR-182   7712  hsmq-0042_01   MIMAT0000261   hsa-miR-183   7513  hsmq-0043_01   MIMAT0000458   hsa-miR-190   7514  hsmq-0044_01   MIMAT0000276   hsa-miR-219-5p   7415  hsmq-0045_01   MIMAT0000077   hsa-miR-22   7516  hsmq-0046_01   MIMAT0000082   hsa-miR-26a   7517  hsmq-0047_01   MIMAT0000100   hsa-miR-29b   7618  hsmq-0048_01   MIMAT0000244   hsa-miR-30c   7619  hsmq-0049_01   MIMAT0000441   hsa-miR-9   7620  hsmq-0050_01   MIMAT0000689   hsa-miR-99b   7521  hsnRNA-U6_01   M14486   hsnRNA-U6   81三：实验内容RNA抽提、RNA 加\"PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析。四：实验主要仪器和试剂主要实验仪器:冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System。主要实验试剂:TRIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、miRNA qPCR Detection Kit。五：实验操作前期准备:为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行Total RNA抽提。1、样品处理:取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞。（Note：如为贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中；如为悬浮细胞，离心收集悬浮细胞，加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞）。2、相分离:室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。3、RNA沉淀:小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。4、RNA洗涤:去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。5、RNA溶解:风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。6、RNA浓度测定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后，在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。Note：如为常规的分光光度计，注意比色杯测定时的最少所需体积量，取一定量的RNA，用DEPC水稀释约100倍左右，同时在紫外条件下测定OD260和OD280，再按照公式计算RNA浓度＝40ng/μL×OD260×稀释倍数）。7、RNA电泳检测：7.1 变性胶制备：取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops)：取50mL10×Mops ，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中。7.3 RNA样品处理：取RNA样品约3μL，最后补充DEPC水至15μL，65℃变性10min后立即冷却，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳。7.4 RNA电泳：先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。8、RNA抽提结果:8.1. RNA电泳图（取3ul RNA 样品）：8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD 260/OD280。RNA来源  RNA浓度(ng/ul )  OD 260/OD280人脑组织   3470  1.99、miRNA 3’端进行加\"Poly A”处理融解加\"PolyA”反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。PolyA Reaction 反应液的配制在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL试剂组分   体积   终浓度Total RNA      2μg2.5U/μLPolyA Polymerase   1μL   2.5U10×PolyA Polymerase Buffer   2μL   1×10×rATP Solution   2μL   1×ddH2O(RNase/DNase free)   补至20μL   在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。Total RNA使用量可在100ng～10μg之间调整，如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在10ng～1μg之间调整。10、PolyA反应：混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存，如需长期保存建议存放于-80℃。11、Poly A化的RNA进行反转录反应：融解反转录反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。RNA-Primer Mix 的配制反应：在冰上预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL试剂组分   体积   终浓度PolyA反应液   2μL   　25×Oligo dT Adaptor   1μL   1×ddH2O(RNase/DNasfree)   10μL   　Final Volume   13μL   　混匀RNA-Primer Mix，短暂离心，直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。配制反转录反应液：在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL。试剂组分   体积   终浓度RNA-Primer Mix   13μL   5×RT Reaction Buffer   5μL   1×25mM dNTP   1μL   1mM25U/μL RNase Inhibitor   1μL   25U200U/μL M-MLV RTase (RNase H free)   1μL   200UddH2O(RNase/DNase free)   4μL   Final Volume   25μL   反转录反应:混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60min, 再进行85℃ 5min灭活处理。 所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。12、qPCR 检测miRNA.miRNA检测引物设计：miRNA qPCR Detection Kit 中已提供有miRNA检测的Reverse 通用引物：\"Universal adaptor PCR Primer”，Forward 检测引物需客户参考miRNA序列自行设计或直接从我公司定购以验证的引物。因为miRNA序列长度一般都在18～24nt之间，所以其检测的 Forward 检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体，其引物可为miRNA 3’端去除几个碱基后整理的序列。miRNA qPCR Forward Primer 设计举例（以小鼠mmu-miR-125b-5p为例）：在miRNA Database中查找检测的miRNA序列，如下图所示：miRNA Database：http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL则其Forward 检测引物可为：miRNA sequence  ucccugagacccuaacuugugaPrimer sequence   tccctgagaccctaacttgtga （Tm：58.8）融解2×qPCR mix(如有必要，融解50×ROX Reference Dye)上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。冰上进行qPCR反应液的配制（所有miRNA进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No template control）测试）试剂组分   体积   终浓度2×qPCR Mix  10μL   1×qPCR Forward Primer（2μM）   2μL  0.2μMUniversal Adaptor PCR （2μM）   2μL  0.2μM1st strand cDNA（diluted 1:5）   2μL  ddH2O  4μL  Final Volume  20μL  1）2×qPCR Mix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。2）Rox Reference Dye使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR仪，如ABI的定量PCR仪。3）引物终浓度可在0.2μM～0.4μM范围内调整，一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。4）1st Strand cDNA 通常需要稀释后再使用 ，防止反转录体系对qPCR体系的影响。5）充分混匀qPCR反应液，添加至PCR反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管底部。6）qPCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）。循环数   步骤   温度   时间   检测1  预变性   95℃   10min   否  变性   95℃   10sec   否40  退火   57℃   20sec   否  延伸   72℃   10sec   是对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）检测温度范围   升温速率   恒温时间   检测70℃～95℃   0.5℃/次   6 sec/次   是30℃      30sec   否1）、2×qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶，95℃ 10min能充分的激活酶活性。2）、因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性，在检测时应严格控制退火温度，防止出现非特异性扩增。3）、进行反转录的Oligo dT Adaptor其长度为53nt，为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右（miRNA序列一般为22nt左右），所以延伸只需10sec即可。 对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79℃～83℃范围内，如果超出此范围，建议使用别的方法来验证产物的特异性（如电泳）。以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器，如使用的为不同公司的定量PCR仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件。六:结果分析20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果20个miRNA及其内参U6的电泳结果图及其检测原始平均Ct值　  Primer ID   Mature_ID   PCR_SIZE   组织   Sample Ave. Ct   胶泳道1  hsmq-0031_01   has-miR-16   75  脑   27.02  12  hsmq-0032_01   hsa-miR-124   73  脑   22.98  23  hsmq-0033_01   hsa-miR-125a-5p   77  脑   27.81  34  hsmq-0034_01   hsa-miR-125b   75  脑   22.58  45  hsmq-0035_01   hsa-miR-137   76  脑   28.51  56  hsmq-0036_01   hsa-miR-139-5p   75  脑   30.66  67  hsmq-0037_01   hsa-miR-145   76  脑   24.7  78  hsmq-0038_01   hsa-miR-149   76  脑   29.71  89  hsmq-0039_01   hsa-miR-153   75  脑   27.61  910  hsmq-0040_01   hsa-miR-154   75  脑   30.39  1011  hsmq-0041_01   hsa-miR-182   77  脑   34.64  1112  hsmq-0042_01   hsa-miR-183   75  脑   33.86  1213  hsmq-0043_01   hsa-miR-190   75  脑   32.28  1314  hsmq-0044_01   hsa-miR-219-5p   74  脑   28.16  1415  hsmq-0045_01   hsa-miR-22   75  脑   24.09  1516  hsmq-0046_01   hsa-miR-26a   75  脑   22.66  1617  hsmq-0047_01   hsa-miR-29b   76  脑   26.72  1718  hsmq-0048_01   hsa-miR-30c   76  脑   26.54  1819  hsmq-0049_01   hsa-miR-9   76  脑   23.11  1920  hsmq-0050_01   hsa-miR-99b   75  脑   27.06  2021  hsnRNA-U6_01   M14486   81  脑   22.26  21产品定购及咨询，请联系殷春婷 13031191229，扣扣867959049编辑：wudihero007