近日，由复旦大学王建华教授领衔，上海交通大学医学院陆劲松教授、孟祥军教授、侯照远研究员作为共同通讯作者，上海交通大学医学院王莹莹为作者，在 The Journal of Clinical Investigation 期刊发表了有关乳腺癌进展新分子机制。 JCI 影响因子 13.251。下面就带大家一起看一下这篇肿瘤高分文章的详细内容。
研究背景
乳腺癌是威胁女性健康的普遍的一种恶性肿瘤。目前虽然有一些针对性治疗方案，但乳腺癌仍具有较高的复发和转移，因此，阐明乳腺癌发生和进展的分子机制对于诊断和治疗将大有裨益。肿瘤的发生和进展受到肿瘤微环境的影响，特别是其中的 CAF 细胞（肿瘤性的成纤维细胞）。在乳腺癌中，CAF 会促进恶性乳腺上皮细胞的转移。转录因子HIC1是一个抑癌基因，在多种肿瘤中都发现存在HIC1基因的表观沉默。HIC1沉默在乳腺癌肿瘤微环境中的作用未见报道。研究内容
研究发现，小鼠中 HIC1 的缺失会导致乳腺细胞的肿瘤早期恶性转化。HIC1 缺失的乳腺细胞分泌趋化因子 CXCL14，通过其受体 GPR85 激活 ERK1/2、Akt 和 neddylation pathway，从而活化乳腺微环境中的成纤维细胞。活化的成纤维细胞反过来通过激活 CCL17/CCR4 趋化因子轴诱导上皮-间质转化而促进乳腺癌细胞的进展和转移。肿瘤细胞和微环境中成纤维细胞间的 crosstalk 在乳腺癌进展中起到了关键作用，本研究为乳腺癌的特异性诊断和治疗提供了新的思路。
乳腺癌进展中 HIC1-CXCL14-CCL17 loop 图
研究路线
研究结果
1、HIC1 的缺失导致乳腺恶性增生及泌乳能力下降。为研究HIC1缺失在乳腺癌进展中的作用，利用杂交获得HIC1conditional knockout 小鼠Hic1-/-，这一小鼠在乳腺特异性的Wap启动子存在的情况下会发生HIC1deletion。与野生型Hic1+/+相比，Hic1-/-小鼠乳腺导管异常增生、上皮层增厚。另外，在 MCF7 细胞中 HIC1 的缺失也会增强形成血管生成网络的能力。结果还显示，HIC1 的缺失同时还会导致乳腺泌乳能力的下降。 2、利用 TCGA 数据进行分析，与对照样品比较，乳腺癌样品中HIC1基因的表达量均出现显著下调。并且随着乳腺癌的进展，HIC1的表达量持续下降。K-M 分析也显示，HIC1 的缺失对应病人更低的生存率。
左图：HIC1在肿瘤 vs 对照以及乳腺癌不同分期中的表达量；右图：HIC1 与病人生存率的 K-M 曲线。
3、HIC1 缺失的乳腺癌细胞能直接激活基质中 CAF。Western blot 检测显示，HIC1缺失小鼠中 CAF marker 基因 α-SMA 表达量的上调，即HIC1的缺失会导致乳腺基质中肿瘤性成纤维细胞 CAF 的活化。中同样存在 CAF 的活化。将正常的成纤维细胞 NAF 与HIC1 缺失的 MCF7 细胞、T47D 细胞分别共培养，4 天后检测显示同样存在 CAF 的活化。
HIC1缺失导致 α-SMA 上调。上图是 Wester blot 结果，下图是免疫荧光染色结果。
4、CXCL14是 HIC1 的靶基因。为了筛选 HIC1 的下游基因，利用已发表的 HIC1 缺失细胞系表达谱芯片数据进行挖掘，在差异表达基因中，筛选到其中 8 个细胞因子基因参与了乳腺成纤维细胞的活化，并通过 RT-PCR 进行了验证，其中趋化因子 CXCL14 差异显著。分析预测CXCL14基因启动子区域有 11 个 HIC1-binding sites (TGCC/GGCA)，通过荧光素酶报告系统实验显示，HIC1 可以直接结合到CXCL14的启动子区域从而调控 CXCL14 的表达。ChIP-PCR 也证明 HIC1 确实可以特异性富集CXCL14启动子序列。
差异表达基因的检测，其中CXCL14在 HIC1 缺失组和对照组中差异显著。
左图：CXCL14启动子上预测的 HIC1 结合位点；右图：HIC1 显著抑制 CXCL14 的表达。
5、CXCL14 参与乳腺成纤维细胞的活化。利用不同浓度的 rhCXCL14 处理乳腺成纤维细胞 NAF，结果显示 rhCXCL14 处理后 NAF 发生显著活化（以 α-SMA 为检测指标）。MCF7 细胞中分别敲除 HIC1、HIC1 和 CXCL14，然后异种移植小鼠，结果显示单独敲除 HIC1 会增加小鼠肿瘤负荷，但同时敲除 CXCL14 可以挽救这一过程。利用 HuProt human proteome microarrays 蛋白芯片筛选 CXCL14 互作的蛋白，最终鉴别到 CXCL14 的受体 GPR85，CXCL14 通过 GPR85 激活下游的 ERK 1/2、Akt 和 neddylation pathway。
CXCL14 敲除可以缓解由于 HIC1 敲除导致的肿瘤负荷增加。
6、CXCL14 活化的成纤维细胞通过 CCL17 诱导乳腺癌细胞的迁移。细胞因子芯片检测显示 CXCL14 活化的成纤维细胞会分泌细胞因子 CCL17、IL-5 和 angiopoietin-2，但只有 CCL17 会促进乳腺癌细胞的迁移。异种移植实验也显示 CCL17 会导致乳腺癌细胞转移到小鼠肺部。并且 rhCCL17 处理会促进上皮-间质转化。CCL17 也与乳腺癌病人的不良预后具有相关性。
左图：CCL17 促进乳腺癌细胞的肺转移；右图：CCL17 与病人预后的 K-M 图。
7、组织芯片验证 HIC1-CXCL14-CCL17 环路。为了在临床样品中验证上述发现，利用包含 228 例良性和恶性乳腺癌样品的组织芯片进行了检测。结果表明恶性乳腺癌样品中，上皮 HIC1 表达量普遍降低，而基质 CXCL14、CCL17、GPR85 和 上皮 CCR4 普遍上升。并且 HIC1 的表达量与 CXCL14、CCL17 的表达量存在显著的负相关，CXCL14 与 CCL17 的表达量存在显著的正相关（p < 0.001）。
组织芯片结果图
研究结论
通过本研究，阐述了乳腺癌进展的分子机制，特别是肿瘤细胞与基质中成纤维细胞 HIC1-CXCL14-CCL17 loop 的作用，即：乳腺细胞中 HIC1 的缺失会导肿瘤的早期恶性转化，乳腺癌细胞分泌细胞因子 CXCL14，通过受体 GPR85 激活 ERK1/2、Akt 和 neddylation pathway 从而活化成纤维细胞，这些活化的成纤维细胞反过来通过激活 CCL17/CCR4 趋化因子轴诱导上皮-间质转化而促进乳腺癌细胞的进展和转移。参考文献
Wang Y, Weng X, Wang L,et al. HIC1 deletion promotes breast cancer progression by activating tumor cell/fibroblast crosstalk.J Clin Invest2018; doi: 10.1172/JCI99974.- END -
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