为什么我们需要针对 COVID-19 进行抗原和抗体检测

2020 年 3 月 24 日冠状病毒、COVID-19、疾病洞察力、免疫测定、新产品

RT-PCR 是病毒诊断的主力，在 COVID-19 病例确认和隔离指导中具有无可估量的价值。然而，虽然快速且灵敏，但 PCR 有一些固有的缺点，限制了它只能在感染的急性期进行诊断。为了更好地理解要了解严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的传播动态并制定有效的应对措施，基于抗原和抗体的免疫测定将是必不可少的。在此博客中，我们解释了用于 COVID-19 诊断的 PCR 和免疫测定之间的主要区别，并介绍了我们不断增加的冠状病毒试剂管线，用于开发高度准确的诊断试剂盒。

病毒诊断：快速回顾< /p>

诊断病毒感染的两种主要方法是聚合酶链反应 (PCR) 和免疫测定：

PCR 聚合酶链反应是一种常规实验室技术，用于扩增少量 DNA 样本变成可以检测和分析的更大数量。对于患者诊断，病毒 RNA 或 DNA 样本通过拭子或抽血采集，然后送往专业实验室进行分析。

对于 SARS-CoV-2 等 RNA 病毒，聚合酶链反应之前有一个额外的步骤来产生 c通过添加逆转录酶（因此称为逆转录-PCR (RT-PCR)）从 RNA 中提取互补 DNA 模板 (cDNA)。

然后通过添加称为 DNA 的短 DNA 序列开始 PCR结合病毒 DNA 链的引物。然后，DNA 的双链部分被耐热聚合酶识别和结合，该聚合酶充当分子复印机以扩展序列并产生完整的互补链。

显示聚合酶链式反应关键阶段的图表。生成后，将添加 cDNA 模板到热循环仪，连同游离核苷酸、引物和 Taq 聚合酶。双链 DNA 被加热变性以产生单链。然后降低温度以允许引物与互补 DNA 序列退火。通过再次升高温度，热稳定Taq 聚合酶可以催化核苷酸添加到生长中的互补 DNA 链。

通过控制退火、延伸和变性步骤以及温度的变化，病毒 DNA 的初始样本可以呈指数级扩增，随后是添加产生可检测信号（通常是荧光）的特定 DNA 探针，以确认病因年龄nt.

免疫测定与分子技术不同，免疫测定检测特定免疫蛋白的存在。这些化验采用各种不同的形式，但基本上由固定在表面（通常是滴定板或纸条）上的抗原或抗体组成，它结合来自患者样本（即痰液）的病毒特异性抗原或抗体或血清）。通过添加进一步的报告蛋白，可以检测病毒特异性免疫信号，以确认是否存在正在进行或过去的病毒感染。

常见示例酶联免疫吸附测定 (ELISA)。1A) 抗原下降 ELISA。滴定板涂有抗原，结合来自患者血清的抗原特异性 IgG 抗体。添加特异性报告抗体，然后确认抗原特异性抗体的存在； 1B) 双抗原桥接试验 (DABA)。滴定板涂有抗原，结合来自患者血清的抗原特异性 IgG 抗体。然后添加第二个报告抗原以创建\"抗原三明治”；1C) 抗体捕获 ELISA。滴度板上涂有wi特异性抗体，它结合来自患者血清的 IgM。然后添加抗原，然后添加报告抗体以改善信号：噪声。有关 ELISA 设计的更多信息，请参阅我们关于 ELISA 格式的博客。

COVID-19 的 PCR

作为一种疾病，COVID-19 表现出相当大的症状变异。个体可能完全没有症状，而有些人可能有轻微的咳嗽和发烧，少数不幸的人可能会出现严重的肺炎和呼吸衰竭[1]。使事情复杂化的是，COVID-19 最常见的症状与其他共同循环的呼吸道疾病所呈现的症状强烈重叠：

症状 COVID-19 普通感冒流感过敏发烧CommonRareCommonOccasional干咳CommonMildCommonOccasionalShortness of BreathCommonNoNoCommonHeadacheOccasionalRareCommonOccasionalAches and PainsOccasionalCommonCommonNoSore Thro atOccasionalCommonCommonNoFatigueOccasionalOccasionalCommonOccasionalDiarrhoeaCommonNoOccasionalNo流鼻涕RareCommonOccasionalCommonSneezingNoCommonNoCommon

表格比较了 COVID-19 与普通感冒、流感和过敏的典型症状。

因此，仅根据临床症状诊断 COVID-19 是非常不准确，必须通过使用高度特异性的诊断测试来确认。幸运的是，由于 SARS-CoV-2 基因组在 1 月初进行了快速测序和发布 [2]，RT-PCR 引物和开放获取协议得以迅速提供，现在全世界的医疗机构都在使用它们来诊断患者。< /p>

RT-PCR 的主要优势在于其速度和灵敏度。从患者喉咙后部取出咽拭子后，可以将样本送到实验室以在数小时内提供结果 [3]。由于只需要极少量的病毒 RNA 即可进行扩增，因此这些测试对于从样本中检测病毒非常敏感。

但是，COVID-19 的 RT-PCR 诊断有其局限性。从咽拭子中检测 SARS-CoV-2abs 需要包含足量完整病毒 RNA 的高质量标本。然而，呼吸道中的 SARS-CoV-2 载量显示出很大差异。这不仅导致假阴性率高，可能的病例在多次拭子检测后仍为阴性，而且进一步使医护人员面临感染风险 [3][4]。

还有一个问题规模。处理 COVID-19 样本需要专门的生物防护实验室，由训练有素的技术人员操作，通常只在大中型医院设施中才能找到 [5]。虽然容量通常足够，但 COVID-19 大流行正在将这些设施推向极限。

对于资源更加有限的国家，诊断基础设施和培训更难获得，许多医疗保健系统只有少数实验室和技术人员分布在广阔的地理区域。政府和私人组织正在快速提高能力和速度PCR 检测，但随着实验室因不断增加的病例数而紧张，延误和完全缺乏检测变得太普遍了 [6]。

免疫测定在哪里适用？

乍一看，免疫测定显示出一些优于 PCR 的明显优势。抗原和抗体比 RNA [7] 稳定得多，这使得它们在运输和储存过程中不易发生裂解，从而减少了假阴性结果的可能性。由于抗原和抗体在痰液和血液样本中的分布更均匀，因此也提高了检测的准确性。

但是，免疫测定的最大优势在于它们能够检测既往感染。

一旦患者从 COVID-19 中康复并且病毒从体内清除，病毒 RNA 就不再可用于在呼吸道中进行检测，在感染的急性期只留下一个很短的窗口，在此期间 SARS-CoV-2 可以被检测到。虽然这对持续感染的诊断很有效，它无法说明患者是否曾感染过病毒，以及他们的免疫状态如何（即他们是否对 COVID-19 免疫或仍易感染）。

与 RNA 不同，抗体是长链- 持久并可在感染后在血液中持续存在多年。因此，免疫测定使我们能够回顾性地识别患有 COVID-19 的患者。抗体的类型及其相对水平也可用于指示感染的阶段和估计接触者追踪接触后的时间。

但是，抗体测试也有其局限性。随着免疫学数据的不断涌现，越来越明显的是人体对 COVID-19 的抗体反应缓慢——比我们预期的要慢得多。虽然此时的数据仍然有限，但最初的 IgM 抗体反应似乎要到初次感染后约 9 天才能达到峰值，而 IgG 抗体反应要到第 11 天才能达到峰值 [8][9]。

COVID-19/SARS-CoV-2 感染典型时间过程中一般生物标志物水平的估计行动。来自 Liu 等人的数据。和李等人。请注意，这纯粹是说明性的，不应用作主要参考。

从这个角度来看，大多数病毒会在 5 天内引发初级 IgM 反应 [10]。因此，SARS-CoV-2 抗体不太可能成为急性 COVID-19 感染的良好标志物。虽然早期研究表明联合 RT-PCR/抗体检测可以降低​​假阴性率 [11]，但仅使用抗体试剂盒进行急性期诊断是一种冒险的策略。

那么在哪里呢？这需要进行抗体测试吗？

虽然抗体可能不适用于急性期诊断，但它们仍然显示出对 COVID-19 的许多有价值的应用。大规模抗体检测最有价值的潜在用途可能是作为一种公共卫生工具。

为了做出正确的公共卫生决策，世界各国政府正在使用对传播率、病例数和病死率的估计（CFR ).然而，鉴于 20-80% 的任何地方COVID-19 病例估计没有症状 [12]，这些数字很难准确建模。在人口层面，这意味着大流行的真实规模和范围仍未确定，政策制定者几乎没有迹象表明 COVID-19 的威胁仍然有多严重，以及预计会持续多久。

通过对公众进行随机抗体抽样（称为血清调查），公共卫生机构可以更好地估计真实的接触水平和由此产生的人群免疫力。对于 COVID-19，这将改变游戏规则，因为可以计算真实传播和病死率，以预测大流行的强度和持续时间，从而指导决策制定。此外，通过确定人群免疫力低下的潜在地理\"热点”，卫生系统可以更好地分配资源以预防或管理传播。

即时检测

虽然抗体不适合诊断对于活动性 COVID-19 感染，从症状发作开始就可能在痰液中检测到抗原 [13]。更重要的是，通过将抗原检测与可以提供快速结果的形式相结合，以便在即时检验 (PoC)、社区甚至上门检测中使用，很快就会成为现实——让那些怀疑的人感染以快速获得结果并确定他们是否应该隔离和/或寻求医疗护理。

ELISA 等形式的主要警告是它们笨重，需要训练有素的科学家在无菌实验室中操作条件——更不用说标本采集和冷链物流的复杂性，它们会耗尽稀缺的医疗保健资源。

幸运的是，一系列 PoC 格式的开发都考虑到了简单性和便携性。所谓的横向流动分析 (LFA) 是最受欢迎的选择。这些简单且易于生产的设备依靠流体分析物的特性通过 ab 移动通过称为毛细管流动的现象自行吸附物质。

la的基本设计流式检测，类似于家庭妊娠试验。 LFA 通常包含一个塑料盒，其中包含一条能够吸收和传输分析物的纸条。 1) 首先将血液或痰液中的分析物添加到纸条的一端，在那里它被纸吸收，使病毒抗原沿着它迁移。 2) 这些抗原首先遇到结合抗体的区域，结合抗体与可检测标签一起粘附在它们上面。 3) 然后抗原迁移到对病毒具有高度特异性的测试抗体区域，并结合产生一条可见的实线，表明阳性结果，从而确认感染。二级控制线随后可用于检测偶联抗体并确保测试正常运行。

这些测试对于在当地社区提供快速诊断、为医疗保健系统和公共卫生机构提供快速诊断具有无可估量的价值正在展开的大流行病的画面更加清晰。

一旦政府能够启动为了减少传播，并且 COVID-19 病例数开始下降，PoC 测试在识别无症状携带者和感染者以确保他们与普通人群隔离方面变得更加重要。

虽然这些工具包不是目前可供广泛使用，世界范围内的公共和私人组织都在研究原型，目前有 50 多种正在开发中 [14]。

开发疫苗

到目前为止，有目前有 40 多种 COVID-19 候选疫苗正在筹备中，Moderna Therapeutic 的领跑者最早将于下个月开始人体试验 [15]。虽然这些疫苗基于广泛的平台（包括 mRNA、DNA、纳米颗粒、亚基、合成肽和病毒样颗粒，仅举几例 [16]），但几乎可以肯定地说，SARS -CoV-2 疫苗会引发对刺突蛋白的免疫反应。

刺突蛋白是大的 I 型跨膜蛋白，突出 f从冠状病毒病毒颗粒的表面。这些蛋白质是免疫显性的（即诱导最强的免疫反应），能够引发高中和抗体滴度（即与病毒结合并阻止其进入细胞的抗体）[17]。

冠状病毒示意图，显示了用于诊断和疫苗开发的关键抗原。有关更多信息刺突蛋白，请参阅我们关于其结构和免疫学的博客。

因此，成功接种 SARS-CoV-2 疫苗将诱导抗刺突 IgG 和 IgM 抗体反应以提供保护。然而，从血清学角度来看-说起来，疫苗诱导的抗体可能无法与自然感染区分开来。

这让疫苗制造商很头疼，他们需要能够区分和测量疫苗特异性免疫反应，以在临床试验期间证明其有效性。因此，在设计检测时需要使用替代抗原，以便能够区分疫苗诱导的免疫反应和自然免疫反应。

虽然有多种抗原可供选择，但核蛋白是一个强有力的竞争者。核蛋白是重要的结构蛋白ein 的主要功能是与病毒 RNA 形成复合物以介导包装和复制。虽然不像 Spike 那样免疫显性，但它具有高免疫原性并且在感染期间大量过度表达 [18]。

然而，使用核蛋白的挑战在于它在冠状病毒株之间的相似性。与刺突不同，核蛋白显示出较少的遗传变异——尤其是在 SARS-CoV-2 和遗传上不同的 2002 SARS 冠状病毒之间。这里的问题是，针对 SARS-CoV 核蛋白的抗体有可能与 SARS-CoV-2 核蛋白发生交叉反应（即相同的抗体能够结合两种冠状病毒的核蛋白）。事实上，研究表明冠状病毒核蛋白具有广泛的交叉反应性 [19][20]。

因此，免疫测定开发人员需要彻底筛选 SARS-CoV-2 核蛋白的抗体结合，并考虑设计创新的免疫测定形式以避免产生假阳性结果。

冠状病毒发病途径，显示中和抗体阻止病毒通过 A 进入的点血管紧张素转换酶 2 (ACE2)。

恢复期血清选项

由于距离疫苗还有一段时间，正在探索中间措施来保护那些最有可能患上严重 COVID- 19 感染。其中之一是被动抗体疗法——一种从康复患者身上抽取血液并进行纯化以保护或治疗个体的技术。

恢复期患者血清的提取、纯化和给药作为 COVID-19 疗法。改编来自 Casadevall 和 Pirofski。

捐献者血液中产生的抗体可作为权宜之计，在个体发展出自身的体液反应来对抗感染时提供即时免疫力。其主要机制是通过中和抗体的作用，还包括抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 和抗体介导的吞噬作用。

被动抗体疗法可追溯到 1918 年流感大流行，并在最近的 2009 年期间发挥了巨大作用H1N1 流感和 2013/2014 年埃博拉流行病，表明接受治疗的患者的生存期显着延长 [21]。对于 COVID-19，抗体可能是既可预防性使用，以保护 COVID-19 病房的医护人员，也可用于治疗严重感染的患者。

要开发活血清，需要对患者的血液进行抗 SARS 筛查-CoV-2 抗体（最好是中和抗体）。这通常通过所谓的噬菌斑中和测定 (PRNT) 来完成。然而，PRNT 吞吐量有限，需要在专门的生物防护设施中进行。因此，免疫测定可能在恢复期血清的定性和定量筛选中发挥关键作用。

The Native Antigen Company 的冠状病毒抗原和抗体

The Native Antigen Company 提供了一种用于人类冠状病毒（包括新发的 SARS-2、SARS、MERS 冠状病毒以及 OC43、HKU1、229E 和 NL63 地方性冠状病毒）的广泛且不断增加的试剂范围。

2020 年 2 月，The Native Antigen公司成为全球首家供应商之一s 释放市售的 SARS-CoV-2 抗原。从那时起，我们的科学家一直在努力工作，扩大我们的冠状病毒范围，以支持迫切需要的诊断试剂和疫苗的研发。

我们的抗原是使用我们专有的 VirtuE (HEK293) 表达系统生产的，确保完全糖基化和正确折叠，以确保完全的生物和抗原活性。要查看我们的产品系列，请单击下面的可用产品。您可以在我们的冠状病毒管道页面上了解最新的新产品开发情况。

如果我们目前没有开发您感兴趣的产品，请联系 contact@thenativeantigencompany.com，

VirusS1S2Whole SpikeNucleoproteinS1 NTDS1 RBDMembraneSARS-CoVAntigens availableAntigens in early developmentAntigens in early developmentNothing checkedAntigens availableSARS-CoV-2 An可用的抗原可用的抗原可用的抗原可用的抗原可用的抗原可用的抗原可用的抗原MERS-CoV可用的抗原还没有预定的没有预定的抗原在后期开发中没有预定的没有预定的没有预定的gens availableAntigens availableNothing yet scheduledNothing yet scheduledNothing yet scheduled229E -CoVAntigens availableNothing yet scheduledAntigens availableNothing yet scheduledNothing scheduledNL63-CoVAntigens availableNothing scheduledAntigens availableAntigens availableNothing yet scheduledNothing yet scheduledNothing yet yet

病毒S1S2Whole SpikeNucleoproteinS1 NTDSARS-CoV Antibodies in early developmentAntibodies availableNothing yet scheduledAntibodies available尚无预定SARS-CoV-2Antibods availableAntibods availableAntibodies availableAntibodys available尚无预定MERS-CoVAntibodys available尚无预定暂无预定暂无预定暂无预定暂无暂定-CoVAntibodies available无yet scheduledNothing yet scheduledNothing yet scheduledNothing yet scheduledNL63-CoVAntibodies availableNothing yet scheduledNothing scheduledNothing yet scheduled

参考文献

1. https://link.springer.com/article/10.1007/s11606-020-05762-w

2。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/

3. https://www.nature.com/articles/d41587-020-00010-2

4. https://www.preprints.org/manuscript/202003.0184/v1

5. https://hbr.org/2020/02/we-need-a-cheap-way-to-diagnose-coronavirus

6. https://www.vox.com/2020/3/20/21188266/coronavirus-test-us-united-states

7. http://book.bionumbers.org/how-fast-do-rnas-and-proteins-degrade/

8。 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.06.20031856v1

9. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/jmv.25727

10。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3820351/

11。 https://papers.ssrn.com/sol3/papers.cfm?abstract_id=3546052

12。 https://science.sciencemag.org/content/early/2020/03/13/science.abb3221

13。 https://jcm.asm.org/content/42/7/2884.short

14。 https://www.finddx.org/covid-19/pipeline/

15。 https://investors.modernatx.com/news-releases/news-release-details/moderna-ships-mrna-vaccine-against-novel-coronavirus-mrna-1273

16。 https://www.who.int/blueprint/priority-diseases/key-action/novel-coronavirus-landscape-ncov.pdf?ua=1

17。 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.28.923011v1

18. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12584316/

19. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2012-7

20。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC404591/

21。 https://www.jci.org/articles/view/138003

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