实验材料 硝酸纤维素或 PVDF 膜（例如，Thermo Scientific 印迹膜，货号88518，或其他同类产品）转印缓冲液（例如，NuPAGE 转印缓冲液，货号 NP0006，Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液，货号 LC3675）漂洗缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲液或磷酸缓冲盐，货号 28360 或 28352）封闭缓冲液（例如，Pierce 澄清牛奶封闭液，货号 37587）孵育托盘和容器一抗（例如，Invitrogen western blot 验证一抗）二抗（例如，Invitrogen western blot 验证 HRP 抗体）化学发光 HRP 底物（例如，SuperSignal West Pico PLUS 或 SuperSignal West Atto 极敏化学发光底物，货号 34580 或 A38555） 实验方案 根据所用蛋白凝胶体系，制备用于湿转或半干转的转印缓冲液。准备转印膜（半干转或湿转转印）。按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。 PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 30 秒钟，使用去离子水短暂漂洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 分钟。硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 分钟。按照生产商的说明书进行湿转、半干转或干式转印。蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 分钟，以去除所有转印缓冲液。室温下，使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜 30–60 分钟。按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。操作贴士湿转推荐—Invitrogen Mini Blot 湿转模块操作指南半干转推荐—Invitrogen Power Blotter 系统操作指南干转推荐—Invitrogen iBlot 2 干转系统操作指南Thermo Scientific 化学发光底物的推荐一抗稀释范围。Pierce ECLSuperSignal West Pico PlusSuperSignal West DuraSuperSignal West FemtoSuperSignal West Atto推荐一抗稀释范围1:1,000 (0.2–10 µg/mL)1:1,000 (0.2–1.0 µg/mL)1:5,000 (0.02–1.0 µg/mL)1:5,000 (0.01-0.2 µg/mL)1:5,000 (0.2–1.0 µg/mL)将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时，或在 2–8℃ 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖印迹膜。使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 10 分钟。使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液稀释HRP二抗。操作贴士 在步骤 8 中，如果使用的是直标一抗，请直接进行步骤 12。Thermo Scientific 化学发光底物的推荐二抗稀释范围。Pierce ECLSuperSignal West Pico PlusSuperSignal West DuraSuperSignal West FemtoSuperSignal West Atto推荐二抗稀释范围1:1,000 - 1:15,000 (0.07–1.0 µg/mL)1:20,000 - 1:100,000 (10–50 ng/mL)1:50,000 - 1:250,000 (4–20 ng/mL)1:100,000 - 1:500,000 (2–10 ng/mL)1:100,000 - 1:250,000 (4–10 ng/mL)将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时。确保抗体工作液可完全覆盖印迹膜。使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 6 次，每次 5 分钟，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。根据生产商的说明书制备化学发光底物的工作液。对于小型印迹，建议准备 8–10 mL 体积的底物工作液，对于中型印迹，建议准备 15 mL 体积的底物工作液（每 m2 的膜大约需要 0.1 mL 工作溶液）。对于常规 ECL 底物，建议使用底物工作液孵育印迹膜 1 分钟，对于高性能底物，比如SuperSignal 底物，建议孵育 5 分钟。将印迹膜从底物工作液中取出并去除多余的液体。将印迹膜置于透明保鲜膜或文件保护膜上，使用气泡滚轮或玻璃移液管滚动以去除气泡。使用胶片或适当的成像系统进行印迹成像。 荧光蛋白质免疫印迹实验方案 点击试剂配方标签页，查看推荐的缓冲液配方 实验材料 硝酸纤维素膜或 PVDF 膜（例如，Thermo Scientific 印迹膜，货号22860，或其他同类产品）转印缓冲液（例如，NuPAGE 转印缓冲液，货号 NP0006，Novex Tris-Glycine 转印缓冲液，货号 LC3675）漂洗缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲液或磷酸缓冲盐，货号 28360 或 28352）经预先过滤的封闭缓冲液（例如，Blocker FL 荧光封闭缓冲液，货号 37565）孵育托盘和容器一抗（例如，Invitrogen western blot 验证一抗）二抗（例如，Invitrogen 荧光标记的高度交叉吸附二抗） 实验方案 根据所用蛋白凝胶体系，制备用于湿转或半干转的转印缓冲液。制备转印膜（半干式或湿转转印）。按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。 PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 30 秒钟，使用去离子水短暂冲洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 分钟。硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 分钟。按照生产商的说明书进行湿转、半干转或干式转印。蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 分钟，以去除所有转印缓冲液。室温下使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜 30–60 分钟。按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时，或在 2–8℃ 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖印迹膜。使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 10 分钟。如果使用荧光直标一抗，请直接进行步骤 11。使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液制备荧光二抗稀释液（0.4-0.1 µg/mL）。对于浓度为 2 mg/mL 的抗体储备液，可按 1:5,000-1:20,000 的比例稀释： 1:5,000: 3 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）1:10,000: 1.5 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）1:20,000: 0.75 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下孵育 1 小时并摇动。确保抗体溶液的体积足够完全覆盖印迹膜，防止强光照射导致荧光染料发生光漂白。使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 6 次，每次 5 分钟，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。印迹可以在湿润时立即成像，也可以在干燥后再进行成像。成像之前，将每个印迹膜置于文件保护膜或清洁的表面上，以防污染。使用具有荧光检测模式的成像系统对印迹进行成像。操作贴士湿转推荐—Invitrogen Mini Blot Module 操作说明半干转推荐—Invitrogen Power Blotter 系统操作说明干转推荐—Invitrogen iBlot 2 干转系统操作说明操作贴士切勿在封闭缓冲液中添加去垢剂，否则可能会增加背景荧光干扰。 使用常规孵育托盘时，小型印迹至少需要 15 mL 封闭液，中型印迹需要 30 mL 封闭液，确保液体完全覆盖转印膜。避免溶液体积过少，因为摇动时的溶液覆盖差异会导致背景过高或者不均匀。操作贴士 可先在孵育托盘中使用蒸馏水反复加入和倾倒 4 次，然后再用漂洗缓冲液进行3次漂洗，每次 5 分钟，以缩短最终的漂洗步骤。操作贴士若要干燥印迹膜，将其置于两片 western blot 滤纸之间，防止干燥时暴露于光照下。干燥后的印迹膜可以保存更长时间，并缩短曝光时间。印迹需避光保存，防止发生光漂白。 Western Blot 缓冲液配方 储存液1 M Tris-HCl, pH 7.6 (100 mL)0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 mL)10% SDS (10 mL)1.0％ 溴酚蓝（10 mL）10X Tris 缓冲液（TBS）10X 磷酸盐缓冲液（PBS）样品制备缓冲液RIPA 裂解液2X Tris-Glycine SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）4X LDS 上样缓冲液电泳缓冲液10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液10X Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液20X MOPS SDS 电泳缓冲液20X MES SDS 电泳缓冲液10X Tricine SDS 电泳缓冲液转印缓冲液25X Tris-Glycine 转印缓冲液20X Bis-Tris 转印缓冲液漂洗缓冲液含 Tween 20 的 Tris 缓冲液（TBST）含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）封闭缓冲液和抗体剥离液5% 脱脂牛奶3% BSA抗体剥离液手灌胶配方SureCast 试剂自选配胶试剂 1 M Tris-HCl, pH 7.6 (100 mL)Tris Base12.11 g去离子水80 mL用 HCl 调节 pH 值至 7.6去离子水至 100 mL0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 mL)Tris Base6.06 g去离子水60 mL用 HCl 调节 pH 值至 6.8去离子水至 100 mL10% SDS（10 mL）SDS1.00 g去离子水至 10 mL1.0％ 溴酚蓝（10 mL）溴酚蓝100 mg去离子水至 10 mL10X Tris 缓冲液（TBS）Tris Base24 gNaCl88 g去离子水900 mL用 HCl 调j节 pH 值至 7.6去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Pierce 20X TBS 缓冲液，500 mL（货号 28358）10X 磷酸盐缓冲液（PBS）NaCl80 gKCl2 gNa2HPO414.4 gNaH2PO42.4 g去离子水900 mL用 NaOH 调节 pH 值至 7.0去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Pierce 20X PBS 缓冲液，500 mL（货号 28348） 样品制备缓冲液 RIPA 裂解液：25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS (100 mL)NaCl0.88 gNP-401 g脱氧胆酸钠1 g10% SDS1 mL1 M Tris-HCl, pH 7.62.5 mL去离子水至 100 mL蛋白酶抑制剂片剂（货号 A32965）2 片即用型推荐产品：Thermo Scientific RIPA 裂解液，100 mL（货号 89900）SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）：63 mM Tris HCl、10% 丙三醇、2% SDS、0.0025% 溴酚蓝，pH 6.8（10 mL）2X 储存液的配方：0.5 M Tris-HCl pH 6.82.5 mL甘油2 mL10% (w/v) SDS4 mL0.1%（w/v) ）溴酚蓝0.5 mL去离子水至 10 mL该缓冲液可在 4℃ 下稳定保存 6 个月。即用型推荐产品：Invitrogen Novex Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液（2X）（货号 LC2676）LDS 上样缓冲液：106 mM Tris HCl、141 mM Tris Base、2% LDS、10% 丙三醇、0.51 mM EDTA、0.22 mM SERVA Blue G250、0.175 mM 酚红，pH 8.5。4X 储存液的配方：Tris HCl0.666 gTris Base0.682 gLDS0.800 gEDTA0.006 g甘油4 gSERVA Blue G250（1% 溶液）0.75 mL酚红（1% 溶液）0.25 mL去离子水至 10 mL该缓冲液可在 4℃ 下稳定保存 6 个月。切勿使用酸或碱调整 pH 值。即用型推荐产品：Invitrogen NuPAGE LDS 上样缓冲液（4X）（货号 NP0007） 电泳缓冲液 Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸、0.1% SDS、pH 8.3。10X 储存液的配方：Tris Base29 g甘氨酸144 gSDS10 g去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Novex Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液（10X），500 mL（货号 LC2675）Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液：25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸，pH 8.3。10X 储存液的配方：Tris Base29 g甘氨酸144 g去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Novex Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液（10X），500 mL（货号 LC2672）MOPS SDS 电泳缓冲液：50 mM MOPS、50 mM Tris Base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.7。20X 储存液的配方：MOPS104.6 gTris Base60.6 gSDS10 gEDTA3.0 g去离子水至 500 mL切勿使用酸或碱调节 pH 值。即用型推荐产品：NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液（20X），500 mL（货号 NP0001）MES SDS 电泳缓冲液：50 mM MES、50 mM Tris Base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.3。20X 储存液的配方：MES97.6 gTris Base60.6 gSDS10 gEDTA3.0 g去离子水至 500 mL切勿使用酸或碱调节 pH 值。即用型推荐产品：NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（20X），500 mL（货号 NP0002）Tricine SDS 电泳缓冲液：100 mM Tris Base、100 mM Tricine、0.1% SDS、pH 8.3。10X 储存液的配方：Tris Base121 gTricine179 gSDS10 g去离子水至 1000 mL该缓冲液可在室温下稳定保存 6 个月。切勿使用酸或碱调节 pH 值。即用型推荐产品：Novex Tricine SDS 电泳缓冲液（10X），500 mL（货号 LC1675） 转印缓冲液配方 Tris-甘氨酸转印缓冲液：12 mM Tris Base、96 mM 甘氨酸，pH 8.3。25X 储存液的配方：Tris Base18.2 g甘氨酸90 g去离子水至 500 mL即用型推荐产品：Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液（25X），500 mL（货号 LC3675）Bis-Tris 转印缓冲液：25 mM Bicine、25 mM Bis-Tris、1 mM EDTA，pH 7.2。20X 储存液的配方：Bicine10.2 gBis-Tris13.1 gEDTA0.75 g去离子水125 mL该缓冲液可在 4℃ 下保持稳定 6 个月。 切勿使用酸或碱调节 pH 值。即用型推荐产品：NuPAGE 转印缓冲液（20X），125 mL（货号 NP0006） 漂洗缓冲液配方 含 Tween 20 的 Tris 缓冲液（TBST）10X TBS100 mLTween 201 mL去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Pierce 20X TBS Tween 20 缓冲液，500 mL（货号 28360）含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）10X TBS100 mLTween 201 mL去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Pierce 20X PBS Tween 20 缓冲液，500 mL（货号 28352） 封闭缓冲液和抗体剥离液配方 5% 脱脂牛奶脱脂奶粉2.5 gTBST 或 PBST不超过 50 mL过滤以去除未溶颗粒物即用型推荐产品：Pierce 澄清牛奶封闭液 10X，100 mL（货号 37587）3% BSABSA1.5 gTBST 或 PBST不超过 50 mL过滤以去除未溶颗粒物即用型推荐产品：Pierce Blocker BSA（10X），TBS 体系，125 mL（货号 37520）Pierce Blocker BSA（10X），PBS 体系（货号 37525）抗体剥离液0.5 M Tris HCl, pH 6.812.5 mL10% SDS20 mL2-巯基乙醇0.8 mL去离子水67.5 mL即用型推荐产品：Restore 抗体剥离液，500 mL（货号 21095）Restore 荧光抗体剥离液（5X），100 mL（货号 62300） 手灌胶配方 使用 SureCast 试剂的手灌胶配方根据下表制备分离胶。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。聚丙烯酰胺浓度%溶液4%6%8%10%12%14%16%18%20%SureCast 预混丙烯酰胺（40%）0.8 mL1.2 mL1.6 mL2.0 mL2.4 mL2.8 mL3.3 mL3.6 mL4.0 mLSureCast 分离胶缓冲液2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL蒸馏水5.1 mL4.7 mL4.3 mL3.9 mL3.5 mL3.1 mL2.7 mL2.3 mL1.9 mL10% SureCast APS80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µLSureCast TEMED*8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL*最后加入，并在倒胶之前充分混合根据下表制备浓缩胶。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。备注：溶液不需要脱气。溶液4%SureCast 预混丙烯酰胺（40%）0.30 mLSureCast 浓缩胶缓冲液0.75 mL蒸馏水1.92 mL10% SureCast APS30 µLSureCast TEMED*3 µL*最后加入，并在倒胶之前充分混合 自选配胶试剂的配方 储存液制备以下储存液：所有溶液均可室温储存。50% 丙烯酰胺/BIS （29:1）48.3 g 丙烯酰胺1.7 g BIS 加水定容至 100 mL。 在避光玻璃瓶中可稳定保存长达两个月。分离胶缓冲液（1 M Tris-HCl，pH 8.8）将 30.3 g Tris 加入 150 mL 水中用 HCl 调节 pH 值至 8.8 加水定容至 250 mL。浓缩胶缓冲液（0.375M Tris HCl，pH 6.8）将 11.4 g Tris 加入约 150 mL 水中用 HCl 调节 pH 值至 6.8 加水定容至 250 mL。催化剂-过硫酸铵（使用当天新鲜配制）100 mg 过硫酸铵 加水定容至 2 mL。10% SDS10.0 g SDS 加水定容至 100 mL。50% 蔗糖50.0 g 蔗糖 加水定容至 100 mL。分离胶以下配方可制备约 25 mL 分离胶，足以用于灌制四块 1.0-mm 厚的小型凝胶 。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。溶液6%凝胶8%凝胶10%凝胶12%凝胶14%凝胶16%凝胶18%凝胶20%凝胶50% 丙烯酰胺/BIS3.0 mL4.0 mL5.0 mL6.0 mL7.0 mL8.0 mL9.0 mL10.0 mL分离胶缓冲液9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL10% SDS250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL50% 蔗糖*4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL水7.8 mL6.8 mL5.8 mL4.8 mL3.7 mL2.7 mL1.7 mL750 µLTEMED**6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL催化剂**625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL*可选，但建议使用，因为它有助于在分离胶和覆盖层之间形成理想的界面。如果忽略不用，则增加水量以补齐蔗糖溶液体积（基于上表数据增加 4.0 mL 水量）。**最后加入，并在倒胶之前充分混合。浓缩胶以下配方可制备 4% 浓缩胶（12.5 mL）溶液4%50% 丙烯酰胺/BIS1.0 mL浓缩胶缓冲液4.2 mL10% SDS125 µL水6.3 mLTEMED*5.0 µL催化剂*1.0 mL*最后加入，并在倒胶之前充分混合。 实验方案 化学发光蛋白质免疫印迹方案荧光蛋白质免疫印迹方案蛋白质免疫印迹缓冲液配方化学发光蛋白质免疫印迹-电子实验记录本荧光蛋白质免疫印迹-电子实验记录本 技术指南 化学发光蛋白质免疫印迹技术指南和实验方案荧光蛋白质免疫印迹 – 多重检测指南荧光蛋白质免疫印迹—入门指南 化学发光检测 化学发光蛋白质免疫印迹实验方案 点击试剂配方标签页，查看推荐的缓冲液配方 实验材料 硝酸纤维素或 PVDF 膜（例如，Thermo Scientific 印迹膜，货号88518，或其他同类产品）转印缓冲液（例如，NuPAGE 转印缓冲液，货号 NP0006，Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液，货号 LC3675）漂洗缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲液或磷酸缓冲盐，货号 28360 或 28352）封闭缓冲液（例如，Pierce 澄清牛奶封闭液，货号 37587）孵育托盘和容器一抗（例如，Invitrogen western blot 验证一抗）二抗（例如，Invitrogen western blot 验证 HRP 抗体）化学发光 HRP 底物（例如，SuperSignal West Pico PLUS 或 SuperSignal West Atto 极敏化学发光底物，货号 34580 或 A38555） 实验方案 根据所用蛋白凝胶体系，制备用于湿转或半干转的转印缓冲液。准备转印膜（半干转或湿转转印）。按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。 PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 30 秒钟，使用去离子水短暂漂洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 分钟。硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 分钟。按照生产商的说明书进行湿转、半干转或干式转印。蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 分钟，以去除所有转印缓冲液。室温下，使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜 30–60 分钟。按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。操作贴士湿转推荐—Invitrogen Mini Blot 湿转模块操作指南半干转推荐—Invitrogen Power Blotter 系统操作指南干转推荐—Invitrogen iBlot 2 干转系统操作指南Thermo Scientific 化学发光底物的推荐一抗稀释范围。Pierce ECLSuperSignal West Pico PlusSuperSignal West DuraSuperSignal West FemtoSuperSignal West Atto推荐一抗稀释范围1:1,000 (0.2–10 µg/mL)1:1,000 (0.2–1.0 µg/mL)1:5,000 (0.02–1.0 µg/mL)1:5,000 (0.01-0.2 µg/mL)1:5,000 (0.2–1.0 µg/mL)将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时，或在 2–8℃ 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖印迹膜。使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 10 分钟。使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液稀释HRP二抗。操作贴士 在步骤 8 中，如果使用的是直标一抗，请直接进行步骤 12。Thermo Scientific 化学发光底物的推荐二抗稀释范围。Pierce ECLSuperSignal West Pico PlusSuperSignal West DuraSuperSignal West FemtoSuperSignal West Atto推荐二抗稀释范围1:1,000 - 1:15,000 (0.07–1.0 µg/mL)1:20,000 - 1:100,000 (10–50 ng/mL)1:50,000 - 1:250,000 (4–20 ng/mL)1:100,000 - 1:500,000 (2–10 ng/mL)1:100,000 - 1:250,000 (4–10 ng/mL)将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时。确保抗体工作液可完全覆盖印迹膜。使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 6 次，每次 5 分钟，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。根据生产商的说明书制备化学发光底物的工作液。对于小型印迹，建议准备 8–10 mL 体积的底物工作液，对于中型印迹，建议准备 15 mL 体积的底物工作液（每 m2 的膜大约需要 0.1 mL 工作溶液）。对于常规 ECL 底物，建议使用底物工作液孵育印迹膜 1 分钟，对于高性能底物，比如SuperSignal 底物，建议孵育 5 分钟。将印迹膜从底物工作液中取出并去除多余的液体。将印迹膜置于透明保鲜膜或文件保护膜上，使用气泡滚轮或玻璃移液管滚动以去除气泡。使用胶片或适当的成像系统进行印迹成像。 荧光检测 荧光蛋白质免疫印迹实验方案 点击试剂配方标签页，查看推荐的缓冲液配方 实验材料 硝酸纤维素膜或 PVDF 膜（例如，Thermo Scientific 印迹膜，货号22860，或其他同类产品）转印缓冲液（例如，NuPAGE 转印缓冲液，货号 NP0006，Novex Tris-Glycine 转印缓冲液，货号 LC3675）漂洗缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲液或磷酸缓冲盐，货号 28360 或 28352）经预先过滤的封闭缓冲液（例如，Blocker FL 荧光封闭缓冲液，货号 37565）孵育托盘和容器一抗（例如，Invitrogen western blot 验证一抗）二抗（例如，Invitrogen 荧光标记的高度交叉吸附二抗） 实验方案 根据所用蛋白凝胶体系，制备用于湿转或半干转的转印缓冲液。制备转印膜（半干式或湿转转印）。按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。 PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 30 秒钟，使用去离子水短暂冲洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 分钟。硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 分钟。按照生产商的说明书进行湿转、半干转或干式转印。蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 分钟，以去除所有转印缓冲液。室温下使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜 30–60 分钟。按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时，或在 2–8℃ 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖印迹膜。使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 10 分钟。如果使用荧光直标一抗，请直接进行步骤 11。使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液制备荧光二抗稀释液（0.4-0.1 µg/mL）。对于浓度为 2 mg/mL 的抗体储备液，可按 1:5,000-1:20,000 的比例稀释： 1:5,000: 3 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）1:10,000: 1.5 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）1:20,000: 0.75 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下孵育 1 小时并摇动。确保抗体溶液的体积足够完全覆盖印迹膜，防止强光照射导致荧光染料发生光漂白。使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 6 次，每次 5 分钟，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。印迹可以在湿润时立即成像，也可以在干燥后再进行成像。成像之前，将每个印迹膜置于文件保护膜或清洁的表面上，以防污染。使用具有荧光检测模式的成像系统对印迹进行成像。操作贴士湿转推荐—Invitrogen Mini Blot Module 操作说明半干转推荐—Invitrogen Power Blotter 系统操作说明干转推荐—Invitrogen iBlot 2 干转系统操作说明操作贴士切勿在封闭缓冲液中添加去垢剂，否则可能会增加背景荧光干扰。 使用常规孵育托盘时，小型印迹至少需要 15 mL 封闭液，中型印迹需要 30 mL 封闭液，确保液体完全覆盖转印膜。避免溶液体积过少，因为摇动时的溶液覆盖差异会导致背景过高或者不均匀。操作贴士 可先在孵育托盘中使用蒸馏水反复加入和倾倒 4 次，然后再用漂洗缓冲液进行3次漂洗，每次 5 分钟，以缩短最终的漂洗步骤。操作贴士若要干燥印迹膜，将其置于两片 western blot 滤纸之间，防止干燥时暴露于光照下。干燥后的印迹膜可以保存更长时间，并缩短曝光时间。印迹需避光保存，防止发生光漂白。 试剂配方 Western Blot 缓冲液配方 储存液1 M Tris-HCl, pH 7.6 (100 mL)0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 mL)10% SDS (10 mL)1.0％ 溴酚蓝（10 mL）10X Tris 缓冲液（TBS）10X 磷酸盐缓冲液（PBS）样品制备缓冲液RIPA 裂解液2X Tris-Glycine SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）4X LDS 上样缓冲液电泳缓冲液10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液10X Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液20X MOPS SDS 电泳缓冲液20X MES SDS 电泳缓冲液10X Tricine SDS 电泳缓冲液转印缓冲液25X Tris-Glycine 转印缓冲液20X Bis-Tris 转印缓冲液漂洗缓冲液含 Tween 20 的 Tris 缓冲液（TBST）含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）封闭缓冲液和抗体剥离液5% 脱脂牛奶3% BSA抗体剥离液手灌胶配方SureCast 试剂自选配胶试剂 1 M Tris-HCl, pH 7.6 (100 mL)Tris Base12.11 g去离子水80 mL用 HCl 调节 pH 值至 7.6去离子水至 100 mL0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 mL)Tris Base6.06 g去离子水60 mL用 HCl 调节 pH 值至 6.8去离子水至 100 mL10% SDS（10 mL）SDS1.00 g去离子水至 10 mL1.0％ 溴酚蓝（10 mL）溴酚蓝100 mg去离子水至 10 mL10X Tris 缓冲液（TBS）Tris Base24 gNaCl88 g去离子水900 mL用 HCl 调j节 pH 值至 7.6去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Pierce 20X TBS 缓冲液，500 mL（货号 28358）10X 磷酸盐缓冲液（PBS）NaCl80 gKCl2 gNa2HPO414.4 gNaH2PO42.4 g去离子水900 mL用 NaOH 调节 pH 值至 7.0去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Pierce 20X PBS 缓冲液，500 mL（货号 28348） 样品制备缓冲液 RIPA 裂解液：25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS (100 mL)NaCl0.88 gNP-401 g脱氧胆酸钠1 g10% SDS1 mL1 M Tris-HCl, pH 7.62.5 mL去离子水至 100 mL蛋白酶抑制剂片剂（货号 A32965）2 片即用型推荐产品：Thermo Scientific RIPA 裂解液，100 mL（货号 89900）SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）：63 mM Tris HCl、10% 丙三醇、2% SDS、0.0025% 溴酚蓝，pH 6.8（10 mL）2X 储存液的配方：0.5 M Tris-HCl pH 6.82.5 mL甘油2 mL10% (w/v) SDS4 mL0.1%（w/v) ）溴酚蓝0.5 mL去离子水至 10 mL该缓冲液可在 4℃ 下稳定保存 6 个月。即用型推荐产品：Invitrogen Novex Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液（2X）（货号 LC2676）LDS 上样缓冲液：106 mM Tris HCl、141 mM Tris Base、2% LDS、10% 丙三醇、0.51 mM EDTA、0.22 mM SERVA Blue G250、0.175 mM 酚红，pH 8.5。4X 储存液的配方：Tris HCl0.666 gTris Base0.682 gLDS0.800 gEDTA0.006 g甘油4 gSERVA Blue G250（1% 溶液）0.75 mL酚红（1% 溶液）0.25 mL去离子水至 10 mL该缓冲液可在 4℃ 下稳定保存 6 个月。切勿使用酸或碱调整 pH 值。即用型推荐产品：Invitrogen NuPAGE LDS 上样缓冲液（4X）（货号 NP0007） 电泳缓冲液 Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸、0.1% SDS、pH 8.3。10X 储存液的配方：Tris Base29 g甘氨酸144 gSDS10 g去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Novex Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液（10X），500 mL（货号 LC2675）Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液：25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸，pH 8.3。10X 储存液的配方：Tris Base29 g甘氨酸144 g去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Novex Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液（10X），500 mL（货号 LC2672）MOPS SDS 电泳缓冲液：50 mM MOPS、50 mM Tris Base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.7。20X 储存液的配方：MOPS104.6 gTris Base60.6 gSDS10 gEDTA3.0 g去离子水至 500 mL切勿使用酸或碱调节 pH 值。即用型推荐产品：NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液（20X），500 mL（货号 NP0001）MES SDS 电泳缓冲液：50 mM MES、50 mM Tris Base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.3。20X 储存液的配方：MES97.6 gTris Base60.6 gSDS10 gEDTA3.0 g去离子水至 500 mL切勿使用酸或碱调节 pH 值。即用型推荐产品：NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（20X），500 mL（货号 NP0002）Tricine SDS 电泳缓冲液：100 mM Tris Base、100 mM Tricine、0.1% SDS、pH 8.3。10X 储存液的配方：Tris Base121 gTricine179 gSDS10 g去离子水至 1000 mL该缓冲液可在室温下稳定保存 6 个月。切勿使用酸或碱调节 pH 值。即用型推荐产品：Novex Tricine SDS 电泳缓冲液（10X），500 mL（货号 LC1675） 转印缓冲液配方 Tris-甘氨酸转印缓冲液：12 mM Tris Base、96 mM 甘氨酸，pH 8.3。25X 储存液的配方：Tris Base18.2 g甘氨酸90 g去离子水至 500 mL即用型推荐产品：Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液（25X），500 mL（货号 LC3675）Bis-Tris 转印缓冲液：25 mM Bicine、25 mM Bis-Tris、1 mM EDTA，pH 7.2。20X 储存液的配方：Bicine10.2 gBis-Tris13.1 gEDTA0.75 g去离子水125 mL该缓冲液可在 4℃ 下保持稳定 6 个月。 切勿使用酸或碱调节 pH 值。即用型推荐产品：NuPAGE 转印缓冲液（20X），125 mL（货号 NP0006） 漂洗缓冲液配方 含 Tween 20 的 Tris 缓冲液（TBST）10X TBS100 mLTween 201 mL去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Pierce 20X TBS Tween 20 缓冲液，500 mL（货号 28360）含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）10X TBS100 mLTween 201 mL去离子水至 1000 mL即用型推荐产品：Pierce 20X PBS Tween 20 缓冲液，500 mL（货号 28352） 封闭缓冲液和抗体剥离液配方 5% 脱脂牛奶脱脂奶粉2.5 gTBST 或 PBST不超过 50 mL过滤以去除未溶颗粒物即用型推荐产品：Pierce 澄清牛奶封闭液 10X，100 mL（货号 37587）3% BSABSA1.5 gTBST 或 PBST不超过 50 mL过滤以去除未溶颗粒物即用型推荐产品：Pierce Blocker BSA（10X），TBS 体系，125 mL（货号 37520）Pierce Blocker BSA（10X），PBS 体系（货号 37525）抗体剥离液0.5 M Tris HCl, pH 6.812.5 mL10% SDS20 mL2-巯基乙醇0.8 mL去离子水67.5 mL即用型推荐产品：Restore 抗体剥离液，500 mL（货号 21095）Restore 荧光抗体剥离液（5X），100 mL（货号 62300） 手灌胶配方 使用 SureCast 试剂的手灌胶配方根据下表制备分离胶。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。聚丙烯酰胺浓度%溶液4%6%8%10%12%14%16%18%20%SureCast 预混丙烯酰胺（40%）0.8 mL1.2 mL1.6 mL2.0 mL2.4 mL2.8 mL3.3 mL3.6 mL4.0 mLSureCast 分离胶缓冲液2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL蒸馏水5.1 mL4.7 mL4.3 mL3.9 mL3.5 mL3.1 mL2.7 mL2.3 mL1.9 mL10% SureCast APS80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µLSureCast TEMED*8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL*最后加入，并在倒胶之前充分混合根据下表制备浓缩胶。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。备注：溶液不需要脱气。溶液4%SureCast 预混丙烯酰胺（40%）0.30 mLSureCast 浓缩胶缓冲液0.75 mL蒸馏水1.92 mL10% SureCast APS30 µLSureCast TEMED*3 µL*最后加入，并在倒胶之前充分混合 自选配胶试剂的配方 储存液制备以下储存液：所有溶液均可室温储存。50% 丙烯酰胺/BIS （29:1）48.3 g 丙烯酰胺1.7 g BIS 加水定容至 100 mL。 在避光玻璃瓶中可稳定保存长达两个月。分离胶缓冲液（1 M Tris-HCl，pH 8.8）将 30.3 g Tris 加入 150 mL 水中用 HCl 调节 pH 值至 8.8 加水定容至 250 mL。浓缩胶缓冲液（0.375M Tris HCl，pH 6.8）将 11.4 g Tris 加入约 150 mL 水中用 HCl 调节 pH 值至 6.8 加水定容至 250 mL。催化剂-过硫酸铵（使用当天新鲜配制）100 mg 过硫酸铵 加水定容至 2 mL。10% SDS10.0 g SDS 加水定容至 100 mL。50% 蔗糖50.0 g 蔗糖 加水定容至 100 mL。分离胶以下配方可制备约 25 mL 分离胶，足以用于灌制四块 1.0-mm 厚的小型凝胶 。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。溶液6%凝胶8%凝胶10%凝胶12%凝胶14%凝胶16%凝胶18%凝胶20%凝胶50% 丙烯酰胺/BIS3.0 mL4.0 mL5.0 mL6.0 mL7.0 mL8.0 mL9.0 mL10.0 mL分离胶缓冲液9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL10% SDS250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL50% 蔗糖*4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL水7.8 mL6.8 mL5.8 mL4.8 mL3.7 mL2.7 mL1.7 mL750 µLTEMED**6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL催化剂**625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL*可选，但建议使用，因为它有助于在分离胶和覆盖层之间形成理想的界面。如果忽略不用，则增加水量以补齐蔗糖溶液体积（基于上表数据增加 4.0 mL 水量）。**最后加入，并在倒胶之前充分混合。浓缩胶以下配方可制备 4% 浓缩胶（12.5 mL）溶液4%50% 丙烯酰胺/BIS1.0 mL浓缩胶缓冲液4.2 mL10% SDS125 µL水6.3 mLTEMED*5.0 µL催化剂*1.0 mL*最后加入，并在倒胶之前充分混合。 技术指南 实验方案 化学发光蛋白质免疫印迹方案荧光蛋白质免疫印迹方案蛋白质免疫印迹缓冲液配方化学发光蛋白质免疫印迹-电子实验记录本荧光蛋白质免疫印迹-电子实验记录本 技术指南 化学发光蛋白质免疫印迹技术指南和实验方案荧光蛋白质免疫印迹 – 多重检测指南荧光蛋白质免疫印迹—入门指南蛋白质免疫印迹学习中心蛋白质免疫印迹常见问题指南蛋白质免疫印迹操作视频仅供研究使用，不可应用于诊断程序。