免疫组织化学复习网络研讨会

通过我们 30 分钟的网络研讨会复习您的免疫组织化学 (IHC) 知识并获得一些技术提示。本次网络研讨会涵盖：

大家好，欢迎来到我们的网络研讨会系列《回到实验室》网络研讨会系列。我叫丽贝卡·东北 (Rebecca Northeast)，最近刚刚加入 Proteintech，成为一名技术专家，来自曼彻斯特大学，担任新陈代谢方面的博士后研究员，当时我正在攻读博士学位。在神经科学中。我为我的研究做了很多 IHC，所以今天我很高兴与您讨论一些提示和技巧，帮助您在这些不幸的休息后充满信心地回到实验室ks。只是要再等一会儿，让更多人参加，但我们很快就会开始。在我讲话的过程中，如果您有任何问题，请随时将其留在问题部分，我的同事威尔将在我讲话时回答您的问题。或者如果他没有时间回答，我会在最后回答。好吧，让我们开始吧。那么，我们将简要回顾一下今天演讲的议程。我们将从公司简介和免疫组织化学介绍开始，介绍 IHC 的应用、开始任何实验之前需要考虑的注意事项、一般方案的简要概述、我们如何进行实验。为我们的研究选择最好的抗体，并查看我们想要的正确对照以使我们的结果有效，然后最后查看 IHC 常见问题的一些故障排除。所以你们中的大多数人可能已经了解 Proteintech，但如果您不知道，这是我们的 com公司介绍，我保证不会花很长时间。我们是抗体的原始制造商，并且自...抱歉，我们自 2002 年以来一直是抗体的原始制造商，并且我们最近获得了 ISO 认证，这意味着我们可以制造 GMP 级细胞因子和生长因子，用于基因治疗中的细胞系。我们在全球拥有五个库存站点，所有产品都有库存，可第二天发货。

主要区别Proteintech 与其他抗体供应商之间的区别在于我们自己生产每件产品，您只能购买带有我们标签的产品。通过消除中间商并不允许其他任何人以其标签销售我们的产品，我们为您提供完全的透明度。还有那这意味着更多的批次间一致性，因为除了直接来自实验室的庞大原始验证数据库之外，我们还可以保证供应，从而对抗体进行全面的质量控制，并确保它在您手中发挥作用。 Proteintech 拥有针对 13,000 个靶标的多克隆抗体和部分单克隆抗体。其中，针对其中两个半千个目标的抗体已通过敲低或敲除验证验证了其特异性。这是业内覆盖范围最广的 KD/KO 验证抗体。

今年，我们推出了用于直接免疫荧光的 CoraLite 荧光染料偶联抗体和用于蛋白质印迹的蛋白梯。作为一家公司，我们通过您的科学成功来衡量我们的成功，特别是帮助您更快地发表有影响力的研究成果。该图显示，在我们公司的历史上，我们的产品每年都有特色并且出版物越来越多。截至今天，我们拥有超过 65,000 个出版物 CI我希望本次网络研讨会和本周的一系列复习讲座能够帮助您成为一名使用 Proteintech 产品发表论文的研究人员。

我们回到正题。什么是免疫组织化学？免疫组织化学简单地指抗体与组织内抗原的结合。在这里，您可以看到石蜡包埋的人类卵巢肿瘤组织，该组织经过 PAX8 染色，PAX8 是一种常见的肿瘤标记物。 IHC 已经存在一段时间了。实际上，它于 1983 年首次被描述，但 Coons 等人于 1942 年首次报道了这项研究，他们使用 FITC 标记的抗体来识别受感染组织中的肺炎球菌抗原。那么免疫组织化学的应用是什么？这些可以用来诊断疾病，观察组织病理学组织，我们可以观察癌症内的预后标志物，这些可以帮助识别任何肿瘤特异性抗原，并允许临床医生将肿瘤定义为是否它是良性的还是恶性的。还可以o 用于诊断组织发生不确定的肿瘤，例如，这些转移是否来自未知的原发肿瘤。

也用于神经退行性疾病。右边是 TDP43 的图像，它是家族性额颞叶变性的标志物，在左边，您可以在患有这种疾病的患者中看到这一点，在右边，您可以在动物中看到这一点小鼠疾病模型。 IHC 还可用于识别脑外伤，因此脑损伤后淀粉样前体蛋白的染色可以帮助检测头部外伤后两到三个小时内的轴突损伤。其他 IHC 实际应用。例如，您可以在基础研究中使用 IHC。常用于基础研究。例如，如果您想对任何基因突变进行表型分析，您可以查看所述突变的敲除如何影响任何下游靶标，无论是在该组织内还是在任何受影响的组织中。证实，特别是在神经科学等领域，越来越多的病毒靶向被用来操纵局部基因表达。这些病毒通常带有 GFP 或类似标签。我们可以放大这些标签，然后可视化病毒靶向是否位于正确的位置。这是我在自己的工作中经常使用的东西。 IHC 在药物发现中也非常有用，因为它可用于查找疾病标志物对某些治疗的反应。在这里我们可以看到 Iba1，它是小胶质细胞的标记。小胶质细胞在中枢神经系统和大脑中非常重要，因为它们充当大脑的巨噬细胞。当它们变得活跃时，就表明大脑受到了感染或压力。在这里您可以看到，在氯胺酮治疗后，这些箭头向您显示更多的小胶质细胞已被激活。

因此，在我们需要开始我们的协议之前，我们需要考虑一些事情呃，首先。所以其中之一就是固定和我们将使用的修复类型。染色前需要固定组织和细胞，这是为了防止细胞和结构崩溃。组织需要通过浸泡或灌注进行长时间的固定过程。通常，最好在灌注甲醛之前尝试灌注 PBS，因为这会去除任何血液，而血液会污染各种抗原并影响我们的染色。甲醛通过交联蛋白质发挥作用。因此，甲醛（例如多聚甲醛或福尔马林）会产生共价交联，本质上使这些蛋白质生长在一起形成不溶性网络。甲醛很好，因为它可以保留细胞形态。然而，这种蛋白质的交联可以掩盖表位，如果使用荧光检测系统，还可以引起自发荧光。丙酮和其他有机溶剂充当强脱水剂的固定剂，因为它们会使细胞脱水并导致蛋白质沉淀对其进行原位迭代和变性。丙酮就是其中之一，它很好，因为它通常对表位温和，可以用作甲醛的替代品。然而，由于固定的性质，它可能会导致脂质成分的损失。在开始之前我们需要考虑的其他一些因素是我们如何准备组织。因此，用甲醛或福尔马林固定的组织通常在切片前包埋在石蜡中，这些通常称为 FFPE 切片，这意味着福尔马林固定和石蜡包埋。因此，当我们获得 FFPE 切片后，一旦它们牢固地嵌入石蜡中，我们就会继续在切片机上切割它们。然而，某些固定步骤可能不适合某些组织，因此，我们可以直接从冷冻中切割这些组织。为了做到这一点，我们将我们的组织嵌入低温保护中，例如 OCT，它代表最佳切割温度化合物。然后我们可以在低温恒温器上切割这些部分然后将它们安装到幻灯片上。因此，低温恒温器、冰冻切片和石蜡 FFPE 切片之间的区别在于，冰冻切片通常可以得到，因为它们不会因固定而掩盖其表位，但确实会遇到一些缺点，例如组织形态不佳和高分辨率下分辨率下降放大倍率。然后，当我们准备样品时要考虑的其他因素是我们切割切片的厚度。因此，我们要确保切片的厚度约为 5 至 10 微米。如果太厚，那么您将获得强信号和高背景，因为组织中存在更多目标抗原，从而产生更多信号。如果它们太薄，则很容易损坏并且通常也难以嵌入。还需要注意的一件事是，在对样品进行切片时，我们希望拥有涂层良好的载玻片。你可以买到很好的商业产品，但你也可以自己制作如有必要，可以通过明胶涂层等方式进行。可以理解的是，我们确实希望我们的组织能够很好地粘附在侧面，否则它们可能会滑落并导致进一步的问题。另外需要考虑的是，如果我们需要进行任何抗原修复，抗原修复通常是如何进行的在染色之前进行，因为这在大多数福尔马林固定的组织中都是必需的，因为这可能会暴露我们固定过程中的任何表位。因此，我们这里的选择是热表位修复，为此，我们将使用柠檬酸盐缓冲液（pH6）或 Tris-EDTA（我们也经常将其用于磷酸盐蛋白）加热载玻片。另一种不太常见的选择是蛋白水解诱导的表位修复，为此需要使用蛋白酶 K 或胰蛋白酶。因此，在这里您可以看到石蜡包埋的扁桃体炎组织，经过不同类型的抗原修复。这些都使用热抗原修复，所以在这里的顶部，你看不到修复l，然后用Tris-EDTA，pH9，可以看到我们的抗原有轻微的特异性染色。然后在底部，你可以看到柠檬酸钠是我们这里抗原修复的最佳选择。那么这两者有什么区别呢？因此，热诱导表位抗原修复是将载玻片在微波炉或高压锅中加热，通常使用 pH 6 左右的柠檬酸盐缓冲液，或使用 pH 值较高的 Tris-EDTA，正如我之前提到的，适用于抗磷酸肼残基的抗体。 PIER，如果您有一个难以恢复的表位，则蛋白水解诱导的表位恢复是很好的选择，并且在中性 pH 条件下，使用蛋白酶 K 或胰蛋白酶，并在 37 度左右孵育。需要注意的是，不均匀的加热可能会导致表位检索不平衡，从而影响您以后的任何分析。如果您使用 PIER，那么太强的酶修复也可能会损害您的组织形态。

所以这是一个通用协议，我只是想说明一下这是一个非常简短的概述，需要根据您的实验需求（例如您的组织类型、抗原丰度、您使用的抗体）调整该方案。我们的网站上有产品特定的方案，我们强烈建议您根据抗体遵循该方案，因为这将为您提供我们实验室已经确定的最佳结果。首先，我们需要去除石蜡，因为石蜡是一种疏水性化合物，如果石蜡残留在组织上，这显然会阻止任何染色。为此，我们使用二甲苯。您现在还可以获得无二甲苯的解决方案，也有助于做到这一点，因为二甲苯不是最好的化合物。继二甲苯之后，您还必须在逐渐减少的乙醇溶液中脱水您的载玻片。接下来，我们进行封闭步骤，封闭步骤对于减少任何非特异性结合非常重要。然后我们需要洗掉封闭液，因此在与我们的一抗一起孵育之前，洗涤步骤非常重要。一抗浓度和孵育应基于制造商的建议或您已知有效的方案。然后，我们需要洗掉一抗，以确保在与二抗孵育之前从系统中去除任何未结合的一抗。在此示例中，我们将与 HRP 标签二抗一起孵育，然后使用 DAB 进行可视化。例如，当使用显色剂并使用 DAB 时，我们要确保仔细计算反应发生所需的时间，以便在停止该 DAB 反应之前不会过度染色或染色不足。然后接下来，您可以使用复染剂，例如 Hoescht，这是一种核染色剂，然后我们需要安装并密封我们的样品。我们需要封闭我们的组织，这是非常重要的一步。封闭步骤，因为这可以防止抗体与组织或 FC 受体的任何非特异性结合。蛋白质封闭通常使用正常血清，血清是一种常见的封闭试剂，因为它含有与非特异性位点结合的抗体。重要的是，封闭血清与我们的一抗产生的物种不同，否则，我们将失去二抗的特异性。 BSA 也是另一种常见的封闭试剂，通常与 Triton-X 结合使用，Triton-X 是一种表面活性剂，有助于润湿、将 BSA 涂覆到我们的组织上。如果使用 HRP 或 AP 等显色剂，在添加二抗和一抗之前，阻断组织中可能存在的任何内源酶非常重要。要为 HRP 执行此操作，通常用 H2O2 封闭，对于碱性磷酸酶，则用乙酸或类似缓冲液封闭。如前所述，这非常重要，因为我们要阻止任何内源酶活性，从而防止任何可能给我们带来假阳性结果的非特异性活动。

选择我们的抗体时，有很多抗体，所以真的重要的是，我们在选择任何抗体（例如新实验或新组织）之前先进行自己的研究。因此，在选择我们的抗体时需要注意的是该抗体可能被引用的次数，特别是查看该抗体是否已用于与您相同的组织、相同的实验类型、相同的固定类型切片甚至 sp例如，ecies。所以这些都可以在我们的网站上找到，您可以看到抗体在哪里被引用以及它用于什么应用和物种。同样非常重要的是，我们查看抗体是如何验证的以及该制造商是否拥有原始验证数据，这样如果您遇到任何问题，您可以与制造商联系，他们可以为您提供此信息。您还想确保您需要的应​​用程序有验证数据，因此在这种情况下免疫组织化学，一般来说，我们想看看您是否需要多克隆抗体或单克隆抗体。一般来说，对于 IHC，最传统的是使用多克隆抗体。只是提醒大家，多克隆抗体是针对整个蛋白质或抗原而产生的抗体，因此它具有更高的亲和力，因为会有很多抗体与多个不同的表位结合。所以这些对大多数人来说都是好事然而，如果您有一种高度丰富的抗原，那么您可能需要使用单克隆抗体，而单克隆抗体仅针对一个表位，因此它们具有更高的特异性，并且不太可能发生交叉反应。最后，在选择一抗时还要考虑的另一件事是，您是否需要在与已有宿主物种不同的宿主物种中培养它。举例来说，您想要进行多重染色实验，最简单的方法是在不同的宿主（例如兔子或小鼠）中培养一抗。因此，当我们购买新的一抗或我们在新的情况下进行测试，例如新的组织、新的物种，你想要优化这个一抗以获得最好的结果。因此，我们建议您执行滴定实验，这将有助于确定您的最佳浓度和孵育时间。组织和目标。如果您有高亲和力抗体和高度可用的靶标，那么您将需要使用低浓度。如果您的可用性目标较低，则情况正好相反，您可能还想尝试增加浓度和孵育时间。如果您有高亲和力抗体或高丰度靶标，那么您只需要很短的孵育时间（通常在室温下）。如果您的靶标难以接近，则需要增加孵育时间，这将有助于其穿透组织。因此，当我们选择用于免疫组化的二抗时，我们确实希望确保我们能够获得最佳信噪比，这意味着背景染色减少。我们需要考虑的另一件事是潜在的子类特异性。如果您使用单克隆抗体，这适用。因此，不同的单克隆抗体和一抗可能具有不同的同种型亚类。你米格ht 具有 IgM 或 IgG2A 亚型，您还可以获得专门针对这些不同亚型的二抗。因此，如果您在小鼠中培养了两种不同的一抗，并且它们具有不同的同种型特异性，并且您将能够使用不同的二抗来执行多重染色，那么这可能会很好。然而，如果您不确定并且您只想靶向您的单克隆抗体，为了确保它能够识别该子类，请确保您的二抗表明它是 IgG 重链和轻链，并且这将靶向在您需要注意的另一件事是交叉吸收。因此，这意味着我们希望减少与其他物种发生交叉反应的可能性。举例来说，我们试图避免任何小鼠与小鼠的组合，因此，例如，在小鼠组织中使用在小鼠中产生的一抗。但是，如果这是您唯一的选择，那么有一些试剂盒，小鼠对小鼠染色试剂盒，可以减少您可能看到的任何背景噪音。您还需要注意的是二抗，即 F(ab\')2 片段。它们在这里缺少 FC 链，并且它们更小，因此更容易穿透组织。您还可以通过与任何内源性 FC 受体结合来减少任何背景信号，这对于具有高 FC 受体浓度的组织（例如脾脏和胸腺）有好处。所以现在我们完成了一抗的孵育，您想考虑一下我们如何\"你要想象这个吗？您可以使用显色或荧光染色来完成此操作。大多数显色检测系统使用 HRP（即辣根过氧化物酶），它会与 DAB 相互作用，形成黑色和棕色不溶性产物；或者使用碱性磷酸酶，它与 AEC 相互作用，形成红色产物。通常这些也带有信号增强器，例如 AEC 复合体。作为显色染料，有荧光染色。因此，荧光染色是将荧光染料附着在我们的一抗上作为直接免疫荧光，或附着在其二抗上作为间接免疫荧光。荧光染色非常适合多色染色面板。现在我将快速介绍一下荧光染色和显色染色之间的区别。因此，荧光染色非常适合多重分析，因为它允许您对同一样本中的多个目标进行成像。您还可以获得更好的共定位，并且可以看到蛋白质与蛋白质与这种荧光染色剂的相互作用。您会说荧光染色具有更高的动态范围，因为这使您可以同时看到高丰度抗原和低丰度抗原。然而，一些n荧光染色的缺点是染色会随着时间的推移而褪色，并且灵敏度也会降低。它还需要更复杂的成像协议，因为您需要更复杂的显微镜，例如在焦点显微镜上进行宽场荧光工作才能看到这些。由于信号放大率更高，显色染色剂更敏感。只要正确存储幻灯片，您就会获得持久的信号，基本上是永远的。您还可以更轻松地成像，因为您只需要一台明场显微镜即可。然而，如前所述，多重和共定位研究的情况稍差。你的动态范围较低，而且协议也稍长一些。所以这些只是荧光和显色染色剂的不同例子。左边是一个使用 DAB 显色染色的示例，用于可视化乳腺癌组织玻片中的 E-钙粘蛋白抗体。右边是荧光染色剂。和在这里，您可以看到两个染色剂，其中红色是我们的 MAP2 抗体，这是一种常见的神经标记物，绿色是我们的 GFAP 抗体，这是一种常见的神经胶质标记物。您可以在这里很好地看到分布。在 Proteintech，我们最近推出了新系列的 CoraLite 荧光染料偶联抗体，这些是我们流行的单克隆和多克隆抗体，它们直接与荧光染料偶联。因此，这就不需要带有荧光团的二抗，因此它们可以作为 IF 研究的完美工具，这些研究需要任何多重共标记并减少任何二抗，因此可以加快您的实验速度并节省您宝贵的时间。< /p>5。控制

继续，我们现在需要考虑实验需要哪些控制。非常重要的是，我们在实验幻灯片的同时运行这些对照，以消除与 t 天的任何差异o 实验之间的天数变化。因此，我们的抗原对照需要包括阳性对照，这就是我们对已知表达目标抗原的组织进行染色的地方。因此，这将确认我们的方案正在发挥作用，并且还将验证任何阴性结果，而不是如果您使用新组织并且看不到任何抗原染色，您可能会认为抗体不起作用或您的方案不起作用不工作。但事实上，如果您使用阳性对照，您将能够验证这一点。我们还需要阴性对照，因此这是我们已知不表达目标抗原的组织的地方，这将揭示任何潜在的假阳性或非特异性信号。在右边，您可以看到我们的 HADHA 抗体，它用于表达 HADHA 的细胞，然后在底部，您可以看到以下 HADHA 的 siRNA，您再也看不到这种特定的染色。另一种抗原控制只是对内源性组织进行染色，因此这就是组织的制备方式与我们的实验完全相同，但是，我们不插管任何一抗或二抗，尤其是在免疫荧光中，这将揭示由于交联固定剂而发生的任何潜在自发荧光。我们还需要考虑试剂对照，这是我们没有一抗的地方，这确保了我们检测到的信号对目标具有特异性。我们还需要单独测试所有荧光团或色原。再次，这确保了我们看到的任何背景噪音都不是特定于我们的目标的。还建议使用同种型对照，您可以在其中与与我们的一抗具有相同同种型和相同浓度的非免疫球蛋白一起孵育。再说一次，这是确保我们观察到的信号是特定的另一种方法。

最后，我们将进行一些快速故障排除查询。如果信号弱或无信号，您会做什么？可能的原因是什么？原因之一是您的一抗或二抗已失去活性，我们建议的解决方案只是使用一批新的抗体，并检查抗体的存储情况，并始终确保您遵循制造商的说明，而不是随心所欲地使用以前做过。例如，在 Proteintech，我们用甘油储存抗体，因此您不需要将它们等分。另一个原因是您的抗体条件可能没有完全优化。我们可以做到这一点的一种方法是滴定我们的抗体浓度并相应地调整孵育时间，直到我们可能看到一些实际的不错的信号。

一个问题是您可能没有表达您感兴趣的蛋白质。因此，如上所述，始终运行阳性对照。如果您的保护感兴趣的基因表达较低，然后尝试信号放大步骤。如果您的表位受损，这可能是由于表位修复不良或固定不良造成的，因此请尝试不同的表位修复技术或不同的固定剂。另一个常见的故障排除询问是您是否有高背景或非特异性染色。因此，这可能是因为您的一抗或二抗浓度过高，因此只需尝试滴定实验即可。如果您有任何非特异性抗体结合，您可能需要尝试延长封闭步骤，增加封闭溶液的浓度。这也可能是由于样品清洗不当造成的。如前所述，在应用封闭抗体（一抗和二抗）后进行彻底的清洗步骤非常重要，因为这会去除系统中任何可能导致进一步信号（尤其是高背景信号）的未结合抗体。如前所述，由于表位受损，您也可能会获得高背景。 ty 不同的表位修复技术或固定剂。最后，如果您发现结果形态不合适，这可能是由于抗原修复条件恶劣，因此您需要优化缓冲液以及温度和 pH 值。您的组织结构可能不清楚。因此，如果您使用的组织切片厚度不正确，则可能会出现这种情况。您感兴趣的蛋白质可能不会表达，因此请尝试使用阳性对照来测试您的实验条件。如果你的组织没有粘在载玻片上，那么这可能会导致它聚集或折叠，这显然会导致不适当的形态。因此，为此，我们建议使用涂层载玻片并确保您具有最佳的固定和表位修复，不会影响您的组织粘附。所以现在演讲结束。非常感谢您的收听和观看。如果您有任何疑问，请写在下面的问题部分，我会等几分钟看看你有没有。否则，请随时给我自己发送电子邮件，rebecca@ptglab.com 或我们在美国的科学官员 Will，他也是一个很好的帮助资源。因此，请随时给我们发电子邮件，无论您身在何处，都祝您度过愉快的一天，我希望您喜欢我们的演讲。录制后，这些内容将在网站上提供，我们的网站上还提供更多资源，以及针对我们各种应用程序的更多提示和技巧以及常见问题解答。我们始终建议您也使用我们的产品特定协议以获得最佳结果。好的，谢谢大家，祝你有美好的一天。