1.3、均相非放射性同位素法上述这些非均相的方法，存在操作繁多的问题。随着技术的发展，越来越多的均相非放射性方法开始被应用于激酶活性的检测之中，根据实验原理的不同，可以分为检测ATP的量、检测ADP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。1.3.1 检测剩余ATP的量有些方法可以利用测定激酶反应中未被消耗掉的ATP量来检测酶活，例如Promega公司的Kinase-Glo 技术。该方法利用激酶反应后剩余的ATP，将荧光素转化为氧化荧光素，并发出化学冷光，荧光信号值与激酶活性成反比。该试剂盒里的重组热稳定荧光素酶(Ultra-GloTM)，发出稳定的\"辉光”型荧光，半衰期大于5个小时，不需要配套进样器的荧光仪，可成批处理大量的微孔板。Ultra-GloTM发出的稳定荧光可适用于多种检测条件，与特定的缓冲液组成相搭配，可减少来自化合物的自发荧光的干扰。该检测方法的成本很低，但为了产生大于2倍的信噪比，至少需要50%的转化率，因此不能用于进行激酶性质的研究，但在ATP产生50%~80%转化率的时候，抑制剂的活性的偏移在2到3倍之间，处于可以接受的范围，因此该方法可适用于抑制剂的高通量筛选。1.3.2 检测ADP的生成量该类方法较易检测一些非多肽底物的激酶活性，如脂激酶，同时也可以测定一些ATP酶的活性。该类方法又可以分为ADP偶联反应，即将ADP转化成其他物质并进行检测，例如Promega的ADP-GloTM；依靠ADP抗体检测的方法，例如Invitrogen的Adapta ，Cisbio的Transcreener 等方法；1.3.2.1 ADP-GloTM ADP-Glo (原理见图1)是Promega公司开发的一种发光法激酶检测方式，检测激酶反应中所形成的ADP的量来反应激酶活性。在该检测方法中，激酶反应中剩余的ATP会首先被ADP-Glo试剂消耗掉；接下来，激酶反应中生成的ADP则会被激酶检测试剂还原成ATP；然后，ATP在Ultra-Glo 萤光素酶的作用下，与荧光素反应发光，发光信号与激酶活性正相关。ADP-Glo 可用于检测几乎任何可生成ADP的酶的活性，不需要抗体参与以及放射性标记。这种检测方法相当敏感，能够检测到的ADP的浓度下限为20 nM。Liu等利用ADP-GloTM技术筛选得到了CK2的抑制剂香豆雌酚，并分析了抑制剂的机制。1.3.2.2 其他检测ADP生成量的方法除了Promega公司的ADP-GloTM以外，很多其他公司也开发了类似检测方法，譬如DiscoveRx公司的ADP Hunter 、Cisbio公司的Transcreener 以及Life technologies公司的Adapta 。其中ADP Hunter 可以利用激酶反应中产生的ADP，将烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)转化为丙酮酸(pyruvate)，并最终转化为荧光信号。该方法可以实时监测激酶的活性变化。而Transcreener 和Adapta 则是在ADP的特异性单克隆抗体上标记铕(Eu)原子，同时再使用d2或者AlexaFluour647等荧光分子标记的ADP来竞争激酶反应的产物ADP，用于检测ADP的生成量。1.3.2.3 检测ADP生成量的方法的优缺点 这些检测ADP的方法，其优点在于：(1)检测产物而非底物，因此灵敏度要远远高于检测ATP消耗量的Kinase-Glo ；(2)不仅可以应用于蛋白激酶的活性检测，同时糖激酶、脂激酶、ATP酶也可以使用此类方法进行活性测定；(3)由于很多激酶本身有内在ATP酶的活性，因此在反应体系中可以考虑不使用多肽底物，从而降低成本。当然，这些方法也有一些相对不足之处，如易受到ATP酶活性的干扰，不能测定活细胞内激酶的活性等。1.3.3 检测带标记或者修饰的多肽产物虽然上述方法可以检测激酶活性，但也有些公司选择对多肽底物进行各种修饰，并应用荧光技术进行检测，如荧光偏振(Fluorescence Polarization, FP)、荧光共轭能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)、时间分辨荧光(Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET)等方法。1.3.3.1 荧光偏振(Fluorescence Polarization, FP) 荧光偏振技术是一种监测分子转动的技术，其原理是物质分子量的大小决定了该物质的运动和转动速度，质量越大，则转动速度和角度越小，当使用偏振光进行激发时，所获得的偏振光的角度也有所不同。荧光偏振的定义公式为P=(III - I⊥)/(III+ I⊥)。其中III表示发射光和激发光平行时的荧光强度，而I⊥则表示发射光和激发光垂直时的荧光强度。荧光偏振不依赖于激发光的强度或者荧光素的浓度。当荧光素自由旋转时，其偏转角度是一个很小的数字，我们称之谓低荧光偏振；而当荧光素和其他大分子结合后，其偏转角度增大，我们称之谓高荧光偏振。很多公司开发了相应的试剂盒，包括Bell-Brook公司的Transcreener FP，DiscoveRx公司的HitHunter ，Millipore公司的KinEASE FP，以及Molecular Devices公司的IMAP FP等等。荧光偏振的优点在于成本较低，均相的反应较易应用于高通量筛选；然而，由于很多因素会导致荧光分子转动速度的变化，因此有一些假阳性和假阴性的结果无法避免。1.3.3.2 荧光共轭能量转移(Fluorescence resonanceenergy transfer, FRET) 荧光共轭能量转移是一种能实现完全自动化激酶活性检测方法。该方法将\"受体”荧光分子和\"供体”荧光分子连接在一起，当\"供体”荧光分子受到激发时，能将非放射性的能量转移到\"受体”荧光分子上，并发生荧光信号。市场上的相关产品众多，譬如Life Technologies公司的Z’-LYTE 以及PerkinElmer公司的AlphaScreen 等。以Z’-LYTETM方法为例，其原理是磷酸化对多肽底物的保护作用(原理见图2)。首先，在多肽底物的N端以及C端，分别标记上\"供体”荧光分子香豆素和\"受体”荧光分子荧光素，这两种荧光分子的发射光谱分别为445 nm和520 nm。如果多肽底物在激酶反应中被磷酸化，就不容易受到蛋白水解酶的水解，FRET依然存在；相反，若激酶反应体系的多肽底物没有被磷酸化，未磷酸化的多肽底物会被蛋白水解酶降解，FRET不复存在。我们可以使用445 nm和520 nm的荧光强度的比率高低(S445/S520)来表示其磷酸化程度：比率越低，则多肽底物的磷酸化程度越高；反之，比率越高，则多肽底物的磷酸化程度越低。Deng等利用该方法得到抑制剂DC120对AKT的EC50值为153 nM。Z-LYTETM检测方法的优点是：(1)信噪比高，读数稳定，操作简单，便于高通量化；(2)无需抗体，试剂价格相对便宜。但此类方法也有明显的缺点：(1)容易受到蛋白水解酶的影响，无法测定多肽底物的一些相关参数，如多肽的 Km值，也不能进行一些较为复杂的抑制剂机制实验；(2)如果化合物本身有很强的自发荧光，尤其在高浓度(如10μM)时，会对结果造成很大的影响，必须经过荧光校正；(3)如果化合物有蛋白水解酶的抑制性，就会产生假阳性的结果。1.3.3.3 时间分辨荧光(Time-resolved fluorescence resonance energy transfer,TR-FRET)时间分辨荧光使用衰减时间较长的荧光分子，如铕(Eu)、钐(II)、铽(Tb)等镧系元素，并在激发一段时间以后再对荧光数值进行检测。时间分辨荧光往往需要采用结合磷酸化多肽底物的单克隆抗体。现有的检测方法有Cisbio公司的HTRF 技术，Life Technologies公司的LanthaScreen 技术以及PerkinElmer公司的Lance 技术等。上述方法将铕(或者铽)标记于多肽底物的单克隆抗体上，作为\"供体”荧光分子，铕的发射光为620 nm左右(铽为480nm左右)；而在多肽底物上标记\"受体”荧光分子，铕对应\"受体”的发射光为665 nm左右(铽对应\"受体”的发射光为520 nm左右)。当多肽底物被磷酸化时，就能够和抗体结合，从而发生能量转移，能够被读取时间分辨荧光的设备所识别。以HTRF 为例，它是均相时间分辨荧光技术的简称(原理见图3)，对TR-FRET技术进行改进，提高了灵敏度和稳定性。通常人们将铕原子和抗体螯合在一起，但这种螯合相对并不稳定，容易受到一些络合剂的影响，如EDTA；而在终止激酶反应时，恰恰需要加入高浓度的EDTA。HTRF 技术使用一种穴状化合物来和铕提供更加稳固的结合，从而避免了铕原子脱落的风险。Htrf是目前应用较广泛的技术，除了用于蛋白激酶抑制剂的筛选外，也可用于研究蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction, PPI)的抑制剂[36]，可溶性蛋白质的量及信号通路相关蛋白的研究。N rskov-Lauritsen等用条件优化后的Htrf方法研究钙离子敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR,CaSR)的信号通路，可对细胞里的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)、肌醇-1-磷酸(D-myo-inositol 1-phosphate, IP1)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2, ERK1/2)定量检测，从而研究CaSR参与调节的多条信号通路的激活状态。以上TR-FRET与抗体技术相结合的检测方法，优点主要有：(1)抗体具有选择性，特异性强，信噪比高；(2)很好的避免了化合物本身的自发荧光对实验的干扰；(3)荧光信号稳定时间更长，无需立即检测。(4)均相反应，易于高通量化。当然，也有以下缺点：(1)特异性单克隆抗体本身比较昂贵；(2)并非所有的磷酸化多肽底物都有现成的抗体。3.3.3.4 迁移率改变法(Mobility Shift Assay) 激酶反应后，部分底物被激酶加上磷酸基团成为产物，因此底物和产物之间相差3个电荷。迁移率改变法就是利用这种差别，使用毛细管电泳将底物和产物分离检测。PerkinElmer的设备Caliper，可以将痕量的激酶反应液转入微流体芯片中，并进行检测(原理见图4)。应用迁移率改变法检测，首先需要在多肽底物的N端接上FAM或者其他荧光标记，并在微孔板中进行酶学反应；同时，吸样针能够将痕量的酶反应液吸入检测芯片内部。由于芯片中分离管路上被施加了电压，带有荧光标记的多肽底物和反应产物由于电荷的不同被分离，然后在检测窗口进行信号的激发和检测。在检测每一个样品时，都可以同时看到底物和产物的信号。通过多肽产物以及多肽底物的峰高比较计算，就可以获知实际转化率。迁移率改变法其优点是可以在不加入中止试剂的情况下，实时监测酶学实验。这样研究酶学性质，尤其是需要动态检测的一些实验，如化合物缓慢结合，不可逆结合测试等变得非常简便。但由于其检测速度较慢——一块384孔板在4针芯片上需要运行大约2~3小时，使得其在药物高通量筛选上的应用，受到很大的限制。3.3.4 配体激酶结合检测法在高通量筛选以及激酶酶谱筛选中，使用激酶活性检测占到了绝对主导地位。然而，我们也可以通过监测激酶和底物结合的情况，用于先导化合物的结构优化，尤其是当纯化获得的激酶基础活性较低或者未知其生化活性时。目前市场上流行的此类方法有Life Technologies公司的LanthaScreen Eu KinaseBinding以及Ambit公司的KinomeScanTM。以LanthaScreen EuKinase Binding为例，其主要原理是使用荧光标记的星型孢菌素(Staurosporine,SSP)或者其他ATP类似物(原理见图5)。首先在表达蛋白激酶时，增加一个小\"尾巴”，譬如说GST或者6个His等等。同时，我们需要找到此类\"尾巴”的特异性单克隆抗体，并用Eu修饰该抗体。这样检测体系包含有荧光标记的ATP类似物，带\"尾巴”的蛋白激酶以及Eu标记的针对\"尾巴”的抗体。其中，Eu标记的抗体能和带\"尾巴”的蛋白激酶结合，而荧光标记的ATP类似物，则能够结合到激酶的ATP结合位点，就能产生TR-FRET。但如果检测体系中包含有蛋白激酶的抑制剂，抑制剂就会取代荧光标记的ATP类似物的位置，从而使TR-FRET降低。配体激酶结合检测法的优点在于：(1)能够检测低活性甚至无活性蛋白激酶，或者一些尚未知晓其生化活性的蛋白激酶；(2)不需要考虑酶促反应的一些限制，操作非常简单；(3)可以实时监测激酶和化合物的解离或者结合情况。但其缺点在于：(1)无法获知激酶的具体活性高低；(2)无法对一些非ATP竞争型抑制的化合物进行筛选或评价。2、激酶检测方法展望虽然多个激酶抑制剂已经被FDA批准，作为药物进行临床治疗，但在治疗过程中也暴露出不少问题。其中，有一个重要问题就是所谓的\"脱靶效应”，即抑制剂除了靶向激酶以外，还会同时抑制其他一些非靶向激酶，并有可能引起一些细胞毒性反应。因此，必须在激酶抑制剂改造研究的前期，就增加激酶酶谱筛选(kinase profiling)。迄今为止，已经涌现了如此众多的激酶检测方法，相信今后会有更多地方法加入其中。即使如此，由于人体激酶谱的复杂性，很难有能够适用于所有激酶检测或者适用于所有研究阶段的方法。因此，必须根据实际需要来进行相应的选择：(1)对于高通量筛选(high throughput screening,HTS)，应该尽量挑选价格便宜且信号窗口比较大的方法，同时速度快，易于操作。(2)对于化合物优化设计阶段，应选择激酶使用量比较低的检测方法，这样检测限度也会比较低。(3)在药物设计中后期，必须要使用激酶酶谱进行筛选，以判断是否有\"脱靶效应”。(4)对于将要进入临床测试检验的候选化合物，要使用\"金标准”放射性同位素方法进行确证。