虽然已经开发了多种抗癌策略，但化疗仍然是大多数癌症的一线治疗方法。 然而，癌细胞可以通过突变变得耐药而容易地从化疗中逃脱，导致相当激进的肿瘤生长。 达卡巴嗪（DTIC）是用于治疗恶性黑素瘤的最流行的烷化剂之一。 DTIC与或不与其他化学药剂如他莫昔芬和IFN- α的 临床试验发现，与单独的DTIC相比，联合疗法不会导致显着延长的存活期。 1, 2, 3没有来自随机对照临床试验的证据表明联合治疗优于单用DTIC治疗转移性皮肤黑色素瘤。 因此，有必要通过克服DTIC诱导的耐药性来增强DTIC对黑素瘤治疗的有益作用。

一些癌症药物在肿瘤DNA中诱导双链断裂（DSB）。 DSB立即被两种主要的核机制修复：同源重组（HR）和非同源末端连接。 重组酶蛋白Rad51是HR中的必需分子。 5非同源末端连接的核心成分是ku70 / 80异二聚体，它结合破碎的DNA末端并募集DNA-PKcs。 Rad51在多种肿瘤中过表达，6, 7表明Rad51抑制可通过增强癌症药物产生的DSB的作用来抑制肿瘤生长。 以前，我们通过短期干扰RNA（siRNA）将顺铂给药与Rad51 mRNA的抑制相结合，成功治疗了小鼠的HeLa细胞肿瘤。 我们发现在HeLa细胞中Rad51表达的稳态水平升高，并且siRNA的Rad51敲低诱导肿瘤对顺铂的敏感性。 另一项研究还表明，Rad51功能的抑制增加了阿霉素对软组织肉瘤的敏感性。 9

与正常成纤维细胞10相比，黑素瘤细胞组成性地表达更高水平的Rad51，并且具有对化学疗法和放射抗性的趋势，可能是由于Rad51依赖性DSB修复。 如果显示DTIC处理在黑素瘤细胞中诱导Rad51表达，则Rad51敲低可以增强黑素瘤的DTIC敏感性。

为了开发针对人类癌症患者的有效Rad51敲低疗法，需要用于 体内 siRNA引入的高效程序。 最近，通过使用日本包膜的血凝病毒（HVJ-E），我们已经实现了相当有效 的体内 siRNA递送，其是作为药物递送载体开发的灭活的仙台病毒颗粒。 11, 12, 13此外，HVJ-E本身诱导多种抗肿瘤免疫，包括树突细胞成熟，NK细胞活化，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）诱导和调节性T细胞抑制。 因此，预期包装到HVJ-E中的治疗性分子，例如寡核苷酸，质粒或siRNA，具有增加的抗癌活性。 在这里，我们测试了DTIC治疗结合Rad51 siRNA包封的HVJ-E的抗肿瘤作用的双重协同作用。 Rad51 siRNA增强了DTIC的癌症杀伤活性，HVJ-E增强了抗肿瘤免疫应答。

我们首先检查了DTIC治疗对F10黑色素瘤细胞中Rad51和Ku70表达的影响。 用DTIC处理F10细胞1小时，然后测量Rad51和Ku70表达。 未处理的F10细胞用作对照。 蛋白质印迹分析表明，用DTIC刺激后0小时Rad51蛋白表达增加1.6倍，而Ku70蛋白表达没有显示出显着变化（图1a和b）​​。 在去除DTIC后的不同时间点测量Rad51和Ku70表达（图1c和d）。 用DTIC刺激后4小时Rad51表达增加1.9倍。

DTIC增加Rad51蛋白的表达。 （ a ）F10细胞中Rad51，Ku70和β-肌动蛋白水平的Western印迹分析; 将2.2m M DTIC加入F10细胞培养物中1小时（ n = 3，每组）。 （ b ） a的统计分析。 将Rad51和Ku70表达归一化为β-肌动蛋白表达。 列是三个样本的平均值。 条形图，sd * P 0.05。 （ c ）在2.2m M DTIC处理后的指定时间点，F10细胞中Rad51，Ku70和β-肌动蛋白水平的Western印迹分析。 对于阳性对照，在γ射线照射后10分钟检测到HEK293细胞中的Ku70和β-肌动蛋白水平。 （ d ）通过β-肌动蛋白强度标准化的Rad51和Ku70（在c中 ）的强度的定量。 （ e ）将2.2m M DTIC加入F10细胞培养物中1小时。 从培养物中取出DTIC后2小时，测定Rad51和γ-H2AX的免疫荧光。 对于阳性对照，在用10Gyγ射线照射后10分钟检查F10细胞。 绿色表示Rad51抗体和Alexa Fluor 488标记的二抗。 红色表示γ-H2AX抗体和Alexa Fluor 546标记的二抗。 比例尺，10μm。

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响应于DSB，组蛋白H2AX被共济失调 - 毛细血管扩张症突变/共济失调毛细血管扩张和RAD3共济失调 - 毛细血管扩张症快速磷酸化，使染色质上的相关PI3K家族激酶突变成γ-H2AX。 免疫荧光研究显示，在1.1m M（200μgml -1 ）DTIC处理后2小时，Rad51灶的数量增加与γ-H2AX灶合并（图1e）。 这两种蛋白质引发HR复合物形成。

然后我们研究了Rad51敲低对F10黑素瘤细胞对DTIC的敏感性的影响。 在通过HVJ-E将Rad51 siRNA引入F10黑素瘤细胞后，我们首先检查了Rad51表达水平。 实时（RT）-PCR分析表明DTIC剂量依赖性地增加Rad51表达。 然而，与scramble siRNA相比，Rad51 siRNA显着抑制了由DTIC处理引起的Rad51表达（图2a）。 在蛋白质印迹分析中，与scramble siRNA相比，Rad51 siRNA抑制由DTIC处理引起的Rad51蛋白表达（图2b）。

Rad51 mRNA和蛋白质被HVJ-E引入的Rad51 siRNA抑制。 在HVJ-E介导的Rad51 siRNA或scramble siRNA转移到F10细胞后24小时进行以下测定。 （ a ）去除DTIC后1小时的Rad51 mRNA的RT-PCR分析。 用DTIC处理细胞1小时。 将Rad51表达标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达。 列，三个独立实验的意思; 条形图，sd * P 0.05，Rad51 siRNA柱与代表性的scramble siRNA柱。 （ b ）用1.1m M DTIC处理F10黑素瘤细胞1小时。 然后，在去除DTIC后1小时，通过蛋白质印迹分析Rad51和β-肌动蛋白。 （ c ）去除2.2m M DTIC处理后指定时间的γ-H2AX和β-肌动蛋白表达的Western印迹分析。 0-h时间点就在DTIC被移除之后。 （ d ） c中对β-肌动蛋白归一化的γ-H2AX的定量。

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蛋白质印迹分析显示含有Rad51 siRNA的F10细胞由DTIC处理引起的γ-H2AX持续增加，而含有争夺siRNA的F10细胞中γ-H2AX的水平在DTIC处理后1小时连续降低（图2c和d） ）。 含有Rad51 siRNA的F10细胞中γ-H2AX的免疫细胞化学显示DTIC处理后细胞核中γ-H2AX灶的数量增加（图3a和b）。 γ-H2AX灶的定量分析表明，与Scramble siRNA转移相比，Rad51 siRNA转移后36小时增加了5倍（图3b）。

在Rad51 siRNA诱导后，DTIC处理引起的DSB未被修复。 （ a ）用1.1m M DTIC处理1小时后，在指定时间内γ-H2AX灶的免疫荧光。 0-h时间点就在从介质中移除DTIC之后。 固定的细胞用γ-H2AX抗体和Alexa Fluor 488标记的二抗染色。 细胞核用4 ，6-二氨基-2-苯基吲哚染色。 比例尺，100微米。 （ b ）相对γ-H2AX水平计算为γ-H2AX焦点与核数之比。

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为了测试 体外 Rad51 siRNA和DTIC组合处理的效果，进行了膜联蛋白V表达的集落形成测定和荧光激活细胞分选分析。 在DTIC处理后F10细胞的集落形成测定中，用Rad51 siRNA转移的细胞的集落数显着减少至scramble siRNA-转移细胞集落数的50.2％（图4a）。

Rad51 siRNA诱导F10细胞对DTIC治疗的更高敏感性。 （ a ）将用HVJ-E载体介导的siRNA（scramble或Rad51）转移的1×10 5 F10细胞培养24小时。 用1.1m M DTIC处理细胞。 二十四小时后，将处理过的细胞以每皿500个细胞的密度接种。 7天后，计数菌落。 列表示三次独立实验的平均值; 条形图，sd * P 0.05。 （ b ）流式细胞术中的膜联蛋白V（+）碘化丙啶（ - ）/碘化丙啶（ - ）表明细胞凋亡。 在通过HVJ-E接受siRNA后，用指定浓度的DTIC处理F10细胞。 白色柱表示scramble siRNA，黑色柱表示Rad51 siRNA。 列是三次独立实验的平均值。 条形图，sd * P 0.05。

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Rad51敲低显着增加DTIC诱导的F10细胞凋亡。 由0.55m M（100μgml -1 ）DTIC和Rad51 siRNA的组合诱导的细胞凋亡与由1.1m M DTIC和scramble siRNA的组合诱导的细胞凋亡没有显着差异（图4b）。 类似地，与2.2m M（400μgml -1 ）DTIC和scramble siRNA的组合处理相比，1.1m M DTIC和Rad51 siRNA的组合显示凋亡细胞数没有显着差异。 这些数据表明，Rad51 siRNA转入F10细胞可以诱导F10细胞对 体外 0.55或1.1 m M DTIC的两倍更高的敏感性。 如B16-F10细胞中所见，DTIC和Rad51 siRNA的组合还增加了B16-F1小鼠黑素瘤细胞对DTIC的敏感性（补充图1a和b）​​。

然后我们评估了除DTIC-Rad51 siRNA组合疗法之外的HVJ-E的抗肿瘤活性。 将含有Rad51 siRNA的HVJ-E三次注射到F10肿瘤中降低了Rad51蛋白的表达（图5a）。 三次瘤内注射磷酸盐缓冲盐水（PBS）或HVJ-E（sc-HVJ：由HVJ-E包围的scramble siRNA，Rad51-HVJ：由HVJ-E包围的Rad51 siRNA）与五次腹膜内注射80mg kg组合-当C57 / BL6小鼠背部的皮内F10肿瘤体积达到40mm 3时施用1DTIC（图5b）。 在接种F10细胞后29天，sc-HVJ + DTIC和Rad51-HVJ + DTIC分别导致肿瘤生长抑制41.9％和77.7％。 因此，与scramble siRNA和DTIC相比，Rad51 siRNA和DTIC的组合对F10肿瘤具有更大的影响。 然而，即使没有DTIC，也观察到显着的肿瘤抑制。 在第29天，与PBS + PBS相比，sc-HVJ + PBS和Rad51-HVJ + PBS分别导致31.6％和29.4％的肿瘤生长抑制。 这些数据显示含有HVJ-E的siRNA抑制 体内 F10肿瘤的生长，而与siRNA的种类无关。

由HVJ-E包围的Rad51 siRNA和DTIC的组合协同地抑制了F10肿瘤的生长。 （ a ）用HVJ-E包围的siRNA转移的F10肿瘤中Rad51和β-肌动蛋白表达的Western印迹分析。 通过在背面皮下注射用5×10 5 F10细胞攻击C57BL / 6小鼠。 在肿瘤达到40mm 3后 ，连续三天将包围2.5nmol siRNA或PBS的1.5×10 3 HAU HVJ-E注射到肿瘤中。 在第三次注射siRNA后24小时移除肿瘤。 与PBS相比，注射Rad51 siRNA的两个肿瘤（第1号和第2号）的Rad51表达水平分别为15.7％和16.3％。 （ b ）肿瘤生长抑制测定。 通过在背面皮下注射用5×10 5 F10细胞攻击C57BL / 6小鼠（ n = 5，每组）。 在肿瘤大小达到40mm 3后 ，在第6, 8和10天每隔一天将1.5×10 3 HAU HVJ-E包封2.5nmol siRNA或PBS注射到肿瘤中.DTIC（80mg / kg）溶于100从第7天到第11天，每天一次腹膜内注射μlPBS或100μlPBS。sc-HVJ：由HVJ-E包围的scramble siRNA，Rad51-HVJ：由HVJ-E包围的Rad51 siRNA。 条形图，sd * P 0.05。 （ c ）F10肿瘤中的定量RT-PCR分析。 在b （ n = 3）中最后一次腹膜内注射DTIC或PBS后48小时从小鼠中取出肿瘤。 条形图，sd * P 0.05。 （ d ）在b （ n = 3）中最后一次腹膜内注射DTIC或PBS后7天从脾脏收集的淋巴细胞的IFN-γ的酶联免疫斑点测定。 条形图，sd * P 0.05。

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HVJ-E通过各种机制诱导抗肿瘤免疫。 然而，尚不清楚HVJ-E诱导的抗肿瘤免疫是否在化学疗法的存在下实现。 我们检测了 体内 HVJ-E诱导的免疫应答。 首先，检查CD4 +和CD8 + T细胞向肿瘤组织的浸润。 定量RT-PCR分析还显示用sc-HVJ + PBS和Rad51-HVJ + DTIC处理的小鼠的肿瘤具有显着增加的CD8 +和CD4 +表达（图5c）。

为了测试HVJ-E诱导的CTL活性，进行酶联免疫斑点测定（图5d）。 来自用sc-HVJ + PBS处理的小鼠的淋巴细胞显示出比对照组，PBS + PBS和PBS + DTIC更多的斑点。 用Rad51-HVJ + DTIC处理的肿瘤也显示出与用scHVJ-PBS处理的肿瘤相同的CTL活性。 因此，由HVJ-E诱导的CTL活性不受DTIC抑制。 这些数据表明HVJ-E激活的适应性免疫不受DTIC治疗的影响，并保持在小鼠肿瘤模型中。

在本研究中，我们证明了DTIC与HVJ-E递送的Rad51 siRNA的组合化疗 在体外 和 体内 显着抑制黑素瘤。 然后显示这种新的治疗策略引起直接凋亡和抗肿瘤免疫，其协同地抑制 体内 肿瘤生长。

迄今为止，已经单独或组合使用许多化学治疗剂来治疗黑素瘤。 然而，这些疗法没有足够的功效来根除黑素瘤细胞，并且经常观察到复发。 为了克服这些困难，有必要增加肿瘤细胞对化学疗法的敏感性或开发用于恶性黑素瘤的新的有效疗法。 已经使用几种方法来增加黑素瘤对DTIC的敏感性。 肿瘤内注射针对Clusterin（一种黑素瘤细胞系中的抗凋亡蛋白）的反义寡核苷酸，改善了对DTIC的易感性。 20个 DNA修复分子也是增加化疗或放疗敏感性的目标。 抑制共济失调 - 毛细血管扩张症突变，共济失调 - 毛细血管扩张症突变相关和聚ADP-核糖聚合酶抑制DNA修复的启动并且与化学疗法组合增强细胞凋亡。 21, 22

在DNA修复分子中，Rad51在HR途径中的DSB修复中起主要作用。 癌细胞已成为高度表达Rad51的趋势的目标。 Rad51启动子驱动的白喉毒素A基因在引入癌细胞时有效诱导细胞凋亡。 23吉非替尼是一种表皮生长因子受体抑制剂，通过阻断ERK1 / 2激活，降低顺铂或丝裂霉素C诱导的Rad51表达。 在吉非替尼抑制Rad51的条件下，人肺癌细胞对化疗药物变得更加敏感。 还显示Rad51表达通过酪氨酸激酶BCR / Abl在慢性髓性白血病中的融合而增加。 Gleevec是一种抑制c-Abl表达的药物，可抑制肿瘤细胞中BCR / Abl融合基因的表达，从而降低Rad 51的表达，增强肿瘤细胞的放射敏感性。 26由于这些原因，Rad51是增加抗癌药物敏感性的有吸引力的目标。

在这里，我们显示DTIC治疗增加小鼠黑素瘤细胞中的Rad51表达，并且DTIC与Rad51 siRNA处理的组合诱导小鼠黑素瘤细胞生长的协同抑制。

DTIC产生 O 6 - 甲基鸟嘌呤作为产生DSB的焦点。 替莫唑胺是增加 O 6- 甲基鸟嘌呤介导的DSB的烷化剂之一。 敲除XRCC2，Rad51复合物的成员，使肿瘤细胞对替莫唑胺敏感。 总之，这些发现表明Rad51介导的HR是 O 6- 甲基鸟嘌呤介导的DSB的常见修复机制。 在DSB之后，修复蛋白质，例如减数分裂重组11和复制蛋白A，募集Rad51以在DSB的位点上形成复合物。 由于需要同源模板，Rad51介导的HR途径在S期和G2期起作用，而Ku介导的非同源末端连接主要在G1期起作用。 之前的一项研究表明，DTIC在小鼠黑色素瘤细胞系中引起细胞周期停滞和DSBs在S期和G2期。 在人结肠癌HCT116细胞中，由喜树碱引起的DSB通过细胞周期检查点诱导的G2阻滞和Rad51介导的HR的快速激活进行协调修复。 在本报告中，显示Rad51表达增加反映了癌细胞中喜树碱产生的DSB，并且在去除喜树碱刺激后维持6小时。 我们的研究还显示去除DTIC后Rad51表达延长。 这些发现表明Rad51介导的HR可能需要几个小时来修复DSB，并且Rad51 siRNA处理必须在此期间靶向通过DSB诱导的细胞凋亡使黑素瘤细胞对DTIC敏感。

在本研究中，我们通过评估增强因子（EF）来观察DTIC治疗与Rad51 siRNA结合但不与sc-siRNA结合时的协同效应，增强因子用于评估联合治疗的协同效应。 32如果EF比对照大两倍，则组合效应被定义为协同效应。 DTIC与Rad51 siRNA的组合的EF相对于DTIC与PBS的组合为3，而DTIC与sc-siRNA的组合的EF相对于DTIC与PBS的组合为1。 这些数据表明HVJ-E引入的Rad51 siRNA 在体内 用DTIC处理协同抑制F10肿瘤生长。

HVJ-E本身通过诱导抗肿瘤免疫进一步增强DTIC化疗联合Rad51 siRNA的抗癌作用。 我们以前报道过HVJ-E对Rad51 siRNA的肿瘤内施用增强了顺铂对严重联合免疫缺陷小鼠HeLa细胞生长的抗肿瘤作用，而没有免疫反应。 然而，我们在此显示，如果用HVJ-E处理，无论其含量如何，在C57 / BL6小鼠的F10细胞肿瘤中对具有浸润效应淋巴细胞的肿瘤细胞的CTL活性的有效诱导是明显的。 因此，scHVJ-PBS组通过诱导针对黑素瘤细胞的CTL显示出一些抗肿瘤活性。 如引言中所述，HVJ-E介导的抗肿瘤免疫的机制涉及各种免疫细胞的激活和失活。 与单独的DTIC相比，先前的化学免疫疗法，例如DTIC与干扰素-α-2b或白细胞介素-2的组合，增强了抗癌功效。 然而，那些化疗免疫疗法未能显着改善晚期黑素瘤患者的存活率。 本研究首次报道显示HVJ-E对Rad51 siRNA的肿瘤内给药将进一步增强DTIC的化学免疫治疗活性，其中HVJ-E介导的CTL活性可 在体内 对抗黑色素瘤细胞。

为了获得由HVJ-E诱导的持续CTL活性，DTIC化疗本身可能由于骨髓清除调节而产生不利影响。 由于DTIC与Rad51 siRNA的联合治疗可以将DTIC的必需剂量减少一半，这种联合治疗似乎具有多种优势，不仅可以克服Rad51诱导引起的DTIC耐药性，而且可以优化DTIC剂量以维持CTL活性。 HVJ-E。

尽管需要进一步精确分析以优化由DTIC组成的化学免疫疗法，但Rad51 siRNA包封的HVJ-E可能是理想的治疗策略，因为DTIC治疗后剩余的肿瘤细胞将被HVJ-E诱导的抗癌消除免疫。 因此，这种新的治疗策略可以提供未来的观点来克服当前恶性黑素瘤治疗的困难。 此外，组合化学免疫疗法的类似策略可以应用于对当前化疗方案具有较低敏感性的其他难治性恶性肿瘤。

总之，Rad51 siRNA处理 在体内 协同增强了DTIC的抗黑素瘤活性。 将Rad51 siRNA递送至黑素瘤细胞的HVJ-E通过诱导抗肿瘤免疫进一步增强了治疗效果。 因此，我们显示Rad51 siRNA包封的HVJ-E与DTIC治疗组合的抗肿瘤作用的双重协同作用。 这种化学疗法与含HVJ-E的治疗分子的组合将为患有难治性癌症（例如恶性黑素瘤）的患者提供有希望的治疗方法。

DTIC购自Kyowa Hakko Co.（日本东京）。 S9-辅因子组购自Oriental Yeast Co.，Ltd（Tokyo，Japan）。 如前所述，通过加入一体积的辅因子溶液（MgCl 2 ，KCl，葡萄糖-6-磷酸，NADPH和NADH在磷酸钠缓冲液，pH 7.4中）制备S9混合物。 小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，B16-F1细胞和人HEK293细胞购自American Tissue Culture Collection（Manassas，VA，USA），其测试细胞的存活力和缺乏污染。 F10细胞在补充有10％胎牛血清和5％青霉素 - 链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中生长。 HEK293细胞在补充有10％胎牛血清和5％青霉素 - 链霉素的最低必需培养基中生长。 将F10细胞和HEK293细胞在37℃下在含有5％CO 2的潮湿气氛中温育。

通过UV照射（99mJcm -2 ）使悬浮液中的HVJ失活。 将灭活的HVJ悬浮液（HVJ-E）在4℃以18, 500g离心15分钟。 然后，除去上清液，并将HVJ-E悬浮于4℃的PBS中。 将Rad51 siRNA（5 -GCAGCGAUGUCCUAGAUAA-3 ）溶液（Dharmacon，Lafayette，CO，USA）与5μl5mgml -1硫酸鱼精蛋白（Nacalai Tesque，Tokyo，Japan）混合5分钟。 将乱序的siRNA（5 -UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ）溶液（Dharmacon）与5μl5mgml -1硫酸鱼精蛋白（Nacalai Tesque）混合5分钟并用作对照。 将HVJ-E与siRNA溶液和Triton X-100（终浓度，0.2％）混合5分钟。 离心（18, 500g，4℃，15分钟）后，除去上清液，将含有siRNA的HVJ-E悬浮于PBS中。

如前所述，将收获的癌细胞悬浮在裂解缓冲液中。 将等量的样品缓冲液与细胞裂解物混合，将样品煮沸5分钟并涡旋两次。 将每种细胞裂解物在12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到0.45μm聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，MA，USA）上。 用5％脱脂乳封闭膜并用一抗探测：小鼠抗Rad51（×100，Spring Bioscience，Pleasanton，CA，USA），小鼠抗β-肌动蛋白（×5000，Sigma，St Louis，MO） ，USA），小鼠抗Ku70（×200，Abcam，Cambridge，UK）或小鼠抗-γ-H2AX×200，Millipore）。 洗涤膜并用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠全IgG（×1000，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden）和山羊抗兔IgG（×1000，Amersham Biosciences）抗体在室温下标记1小时。 按照制造商（Amersham，Buckinghamshire，UK）提供的标准方案进行化学发光检测。 西方乐队由Photoshop软件（Adobe）编辑。 Rad51，γ-H2AX和β-肌动蛋白的半定量化通过Scion Image软件的光密度分析进行。 通过单击特殊，加载宏，打开宏，选择Gelplot2，打开图像文件，选择图像的带区域，打开Mark First Lane，打开Plot Lanes3，选择区域并选择结果，按顺序计算印迹。

药物处理的细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，用0.1％Triton X-100透化10分钟，并用5％山羊血清在室温下封闭1小时。 将载玻片与一抗，小鼠抗Rad51（×100，Spring Bioscience）或兔抗小鼠γ-H2AX（×200，Calbiochem，Frankfurt，Germany）一起温育1小时。 细胞核用4 ，6-二氨基-2-苯基吲哚染色。 将载玻片与缀合至山羊抗小鼠IgG Alexa 488或山羊抗兔IgG Alexa 546（×500，Molecular Probes，Carlsbad，CA，USA）的第二抗体温育1小时。 使用配备有倒置Nikon Eclipse TE-2000显微镜（Nikon，Tokyo，Japan）和Plan-Apo物镜（Nikon）的Radiance 2100激光扫描共聚焦显微镜系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）分析细胞。 。 通过Photoshop软件（Adobe）调整所有图像的对比度。 用Image J测定γ-H2AX计数。

对于 体外 测定，通过高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）将从肿瘤中提取的2μg总RNA逆转录成cDNA，并通过实时定量RT-PCR扩增。 ABI PRISM 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）在以下条件下：40个循环的94℃变性45秒，49℃退火45秒和68℃延伸2分钟。 对于 体内 分析，使用Isogen（Nippon Gene，Tokyo，Japan）从已经切除并在PBS中洗涤的肿瘤中提取总RNA。 将总量为2μg的总RNA逆转录成cDNA并进行 体外 分析。 对于鼠Rad51，CD8 + ，CD4 +和甘油醛-3-磷酸脱氢酶特异的探针和引物对购自Applied Biosystems。 通过使用比较阈值循环方法（扩增曲线和阈值之间的交叉点处的阈值循环数）确定靶基因的浓度，并将值标准化为内部甘油醛-3-磷酸脱氢酶对照。

将F10细胞（1×10 5 ）在六孔板中培养。 每孔300个HAU HVJ-E载体介导的200pmol siRNA转染后24小时，用1.1m M DTIC处理细胞。 二十四小时后，将处理过的细胞以每皿500个细胞的密度接种在10cm培养皿中。 7天后，将菌落用甲醇固定，用台盼蓝（Nacalai Tesque）染色，并计数。

将F10细胞（每孔1×10 5个）在六孔板中培养。 在每孔300HAU HVJ-E转移200pmol siRNA后24小时，用0.55, 1.1或2.2m M DTIC处理细胞。 二十四小时后，用PBS洗涤处理过的细胞两次，并重悬于标记溶液中。 将总共​​5μl的膜联蛋白V和5μl的碘化丙锭（Becton Dickinson PharMingen，San Diego，CA，USA）加入到重悬的溶液中。 在室温下在黑暗中温育20分钟后，用荧光激活细胞分选流式细胞仪（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA）和Cell Quest软件（Becton Dickinson）分析染色的细胞。

通过在背面皮下注射，用5×10 5 F10细胞攻击雌性5-6周龄C57BL / 6小鼠（购自Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA）。 在肿瘤达到40mm 3后 ，将包含在100μlPBS或PBS中的2.5nmol siRNA的1.5×10 3 HAU HVJ-E注射到肿瘤中。 将溶解在100μlPBS或100μlPBS中的DTIC（80mg kg -1 ）腹膜内注射到小鼠体内。 通过下式测量肿瘤体积：肿瘤体积（mm 3 ）=长度×（宽度）2/2。

在第五次腹膜内注射后7天处死小鼠。 Splenocytes were harvested from the spleen and cultured as in the previous study. 15 A total of 1 × 10 4 lymphocytes were cultured with 0.2 × 10 4 mitomycin C-treated F10 cells at 37 °C for 24 h. The assay was performed by using a mouse IFN-γ enzyme-linked immunospot kit (R D Systems, Minneapolis, MN, USA). The number of spots was subsequently counted under a dissecting microscope (Leica, Cambridge, UK).

The EF was calculated by dividing the normalized tumor growth delay by the absolute growth delay. 33 Absolute growth delay was defined as the time, in days, for tumors to reach 1967 mm 3 (the average tumor size of the combination group treated with Rad51-HVJ and DTIC at 29 days) in the treated group minus the mean time to reach 1967 mm 3 in the untreated control group (PBS). The normalized tumor growth delay was defined as the time, in days, for tumors to reach 1967 mm 3 in mice treated by the combination treatment minus the time, in days, for tumors to reach 1967 mm 3 in the group treated with DTIC alone.

In vitro results were analyzed with the Student s non-paired t -test. Post hoc multiple comparisons of in vivo results were made by using Tukey s test. Differences with P -values 0.05 were considered statistically significant.

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