【CNS前沿文献追踪】 – 外泌体PD-L1和anti-PD-1疗法响应率存在关联

北京德泉发布时间：2018/08/21 16:08 点击: 加载中..

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免疫检查点很热，外泌体也很热，此次分享的文章将两大热点联系到了一起，发现外泌体（EV）表面表达PD-L1，可发挥免疫抑制作用。分析临床病人后发现外泌体PD-L1水平和免疫检查点单抗药物响应率存在相关性，具体内容如下：

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差速离心分离纯化出原发或转移型黑色素瘤病人血液中的外泌体（EV）后用电镜、纳米粒度仪表征

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反向蛋白芯片、WB分析原发型及转移型黑色瘤病人的全细胞（W/WCL）、外泌体（E/EXO）后发现：转移型肿瘤病人血液中外泌体PD-L1含量更高（两类肿瘤细胞PD-L1含量无差异）

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换一种外泌体分离方法-密度梯度离心法制备外泌体后也确证外泌体含PD-L1（严谨！连外泌体制备方法都尝试多种）

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囊泡（MV）也含PD-L1，但比外泌体含量低，再结合前面两种细胞总PD-L1含量无差异而外泌体PD-L1含量有差异的数据，暗示外泌体PD-L1值得关注

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蛋白芯片、WB的数据只能说明外泌体含PD-L1蛋白，但无法判断PD-L1在外泌体上表达的位置，免疫金法发现外泌体PD-L1表达于外泌体膜表面

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ELISA法也确证PD-L1表达于外泌体表面，另一方面肿瘤细胞受IFN-γ刺激后PD-L1表达水平会升高，ELISA、WB检测发现INF-γ刺激的肿瘤细胞分泌的外泌体PD-L1水平也升高

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表达PD-L1的外泌体可与PD-1结合：IFN-γ刺激的细胞分泌的外泌体PD-L1水平高，结合的PD-1多；PD-L1抗体可阻断外泌体和PD-1的结合，暗示外泌体表面的PD-L1保留着和PD-1互作的功能

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细胞分泌外泌体有相应的通路（ESCRT），沉默通路中关键的蛋白Hrs后外泌体PD-L1水平降低 - 在反向验证，PD-L1是\"有意”装载在外泌体而非偶然\"沾”上的

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外泌体分泌通路中关键蛋白Hrs、外泌体marker CD63可与PD-L1互作（IP、共定位），更进一步说明外泌体表达PD-L1是细胞\"有意为之”的

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沉默调控外泌体释放的关键蛋白Rab27后在全细胞（WCL）PD-L1水平升高，外泌体（EXO）PD-L1水平降低，暗示细胞中绝大部分PD-L1通过外泌体\"放出去执行任务了”

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In vivo验证：种瘤小鼠分泌的外泌体才表达PD-L1，且表达量和肿瘤大小正相关，说明肿瘤细胞在体内可分泌表达PD-L1的外泌体

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人的In vivo数据：分离出健康人（HD）、黑色素瘤患者（MP）的外泌体、囊泡，发现主要是外泌体表达PD-L1，且肿瘤患者外泌体PD-L1水平更高，外泌体是造成健康人和肿瘤患者PD-L1水平差异的决定性因素

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感受性曲线（ROC）分析显示外泌体PD-L1水平可区分健康人和肿瘤患者

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前面那么大的篇幅严谨的说明了肿瘤细胞分泌的外泌体表达PD-L1，可与PD-1互作。生理条件下是表达PD-L1的肿瘤细胞和表达PD-1的T细胞互作后抑制T细胞的功能，开始研究PD-L1外泌体的功能：第一步，PD-L1外泌体可与CD8 T细胞互作（CFSE标记的外泌体和CD8 T细胞共定位）

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流式方法从更有统计学意义的角度说明PD-L1和CD8 T细胞发生了互作

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证明了PD-L1外泌体可与CD8 T细胞互作之后，在研究PD-L1外泌体对T细胞功能的影响之前，文章作者构建了工具细胞系：MEL624细胞本身不表达PD-L1，分泌的外泌体也不表达PD-L1，外源性地让MEL624表达PD-L1，表达了PD-L1之后的细胞分泌的外泌体也表达PD-L1了

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In vitro：表达PD-L1细胞分泌的外泌体可抑制激活的CD8 T细胞的增殖、细胞因子的分泌，PD-L1抗体可rescue外泌体对CD8 T细胞的抑制作用

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In vitro：换个黑色素肿瘤细胞系再次验证PD-L1外泌体对CD8 T细胞的抑制作用

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In vitro：肺癌、乳腺癌的细胞系也会释放表达PD-L1的外泌体，这些外泌体也能够抑制CD8 T细胞的功能

In vitro验证PD-L1外泌体的功能之后开始in vivo验证：小鼠接种敲除了PD-L1的肿瘤，给予PD-L1外泌体会促进肿瘤细胞的生长，在给予PD-L1外泌体的同时给予PD-L1抗体则能够阻断部分促瘤作用

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In vivo深入探究发现PD-L1外泌体抑制了PD-1+ CD8 T细胞的功能，PD-L1抗体可缓解抑制作用

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In vivo深入探究发现PD-L1外泌体抑制CD8 T细胞对肿瘤的浸润，PD-L1抗体可缓解抑制作用

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小鼠in vivo模型上看到了PD-L1外泌体对肿瘤免疫的抑制作用，开始看临床病人的in vivo，比对anti PD-1疗法响应与否的病人发现：响应者与非响应者总体PD-L1水平无差异，只有外泌体PD-L1水平存在差异

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外泌体PD-L1水平高的病人对anti PD-1疗法客观响应率（OOR）低，外泌体PD-L1水平和肿瘤病人IFN-γ、肿瘤负荷正相关

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分析病人外泌体PD-L1含量的变化，在第6周达到峰值

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囊泡上PD-L1第6周也达到峰值，但增量不如外泌体上多

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外泌体上PD-L1达到峰值后，PD-1+ CD8 T细胞增殖受阻

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在前3-6周外泌体PD-L1增量越高对anti-PD1疗法越响应

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进一步分析，当外泌体PD-L1增量达2.43时和客观响应率相关性最好（PD-L1总水平、非外泌体PD-L1水平和客观响应率相关性不大）

笔者看到的外泌体高分文章关注的大多都是外泌体中非编码RNA的生物活性，大海捞针一样找到外泌体中某些核酸片段。这篇文章则很轻巧 - 外泌体大家都很熟悉、免疫检查点肿瘤免疫大家也很熟悉，可就是没人发现两者之间的相关性，作者不拘泥于基础研究只在动物模型上验证，还去临床找样本、抓数据，理论价值、现实意义都很深远，思维简单朴素、平凡伟大！

Gang Chen, Alexander C. Huang, Wei Guo et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. [J] . Nature, 08 August 2018.

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